Die Bedeutung posttranskriptionaler Regulation in Stressantwortsystemen und Differenzierungsprozessen in Prokaryoten wurde in den letzten Jahren immer mehr erkannt und erforscht. Die Suche nach noch unbekannten Proteolysesubstraten ist schwierig, da Regulatoren meist in geringen zellulären Konzentrationen vorliegen und daher durch direkte Färbeverfahren nicht detektierbar sind. Daher wurde hier eine Methode zur Identifikation von Proteolyse-kontrollierten Regulatoren entwickelt mithilfe von Transkriptomanalyse von Proteasemutanten (lon und clpP) versus Wildtypzellen mit DNA-Microarrays in Escherichia coli. So war es möglich, mehrere Regulons zu bestimmen, welche differenziell in den Mutanten exprimiert werden, z.B. viele σS–abhängige Gene und, besonders markant, Gene der Säurestressantwort, welche im lon Hintergrund verstärkt und in der clpP Deletionsmutante vermindert transkribiert werden. Das Glutamat-abhängige Säureresistenz-System, kodiert von gadA/BC, ist essentiell für Escherichia coli, um die Passage durch den hochsauren Magen zu überleben. Das System wird induziert bei niedrigem pH und bei Eintritt in die stationäre Phase. Diese Regulation benötigt den Masterregulator σS, welcher die Synthese von GadE und GadX antreibt, die als essentieller, zentraler Aktivator bzw. als Modulator der Expression dieser Gene agieren (Weber et al., 2005). Ein anderer regulatorischer Schaltkreis beinhaltet das EvgA/S Zweikomponenten-System und YdeO, welche einen positiven Feedforward Loop bilden, um gadE zu regulieren (Foster, 2004). Während der Masterregulator σS unter proteolytischer Kontrolle steht (Hengge-Aronis, 2002), wurde in dieser Arbeit ermittelt, dass auch GadE auf den Ebenen der Expression und des Abbaus kontrolliert wird. In-vivo-Abbausexperimente zeigten, dass GadE konstitutiv von der Lon Protease abgebaut wird. Immunoblot- und Reportergenfusions-Daten bezeugen, dass der schnelle Anstieg des GadE- Gehaltes nach Säureshift aufgrund posttranskriptionaler Kontrolle stattfindet, die kleine RNA DsrA involvierend, während die transkriptionale Induktion die langsame Reaktion auf andauernden Säurestress liefert. Die Lon-vermittelte Proteolyse von GadE ist entscheidend für die schnelle Termination der Antwort, gezeigt durch GadE Immunoblot und gadA/BC Northern Blots in lon+/-. Andere in- vivo-Abbauexperimente und GFP-Fusions-Studien weisen auf weitere Kandidaten proteolytischer Kontrolle, wie YdeO und GadW, innerhalb dieses Systemes hin, damit eine Basis für zukünftige Studien schaffend. In Microarray-Studien und LacZ-Reportergenfusions-Studien wurden voneinander abgegrenzte Gengruppen identifiziert, die entweder von GadE und GadX zusammen oder nur von GadX kontrolliert werden. Die komplexe regulatorische Architektur konnte in den prinzipiellen Signalwegen aufgeklärt werden und ein Modell wurde entwickelt, welches die Regulationsmechanismen und Dynamiken des Säurestressantwort- Netzwerkes integriert.
The impact of posttranscriptional regulation in stress response systems and differentiation processes in prokaryotes are increasingly recognized and investigated in the recent years. The search for yet unknown regulatory substrates of proteolysis faces the difficulty that regulators are usually present in small amounts in bacteria, difficult to detect through direct staining procedures. Therefore a method for identifying regulators subjected to proteolysis was developed using transcriptomic analysis of protease mutants (lon and clpP) versus wildtype cells via DNA microarrays in Escherichia coli. This way it was possible to determine several regulons which are differentially expressed in the mutants, e.g. many σS-dependent genes, and, as the most prominent, genes of the acid stress response, which are upregulated in the lon background and downregulated in the clpP deletion strain. The Glutamate-dependent acid resistance system, encoded by the gadA/BC genes, is essential for Escherichia coli to survive the passage through the highly acidic stomach. The system is induced at low pH and during entry into stationary phase. This regulation involves the master regulator σS, which drives the expression of GadE and GadX, which act as the essential key activator and as a modulator, respectively, for the expression of these genes (Weber et al., 2005). Another transcriptional regulatory circuit implies the EvgA/S two-component system and YdeO, which form a positive feedforward loop regulating gadE (Foster, 2004). While the master regulator σS has long been known to be under proteolytic control (Hengge-Aronis, 2002), it is established here that also GadE is controlled both at the levels of expression and degradation. In-vivo degradation experiments show that GadE is constitutively degraded by the Lon protease. Immunoblot and reporter fusion data indicate that the rapid increase in GadE levels upon pH downshift is due to posttranscriptional regulation involving the small RNA DsrA, while transcriptional induction provides the slow reactions to enduring acid threat and during entry into stationary phase. Lon-mediated proteolysis of GadE is crucial for the rapid termination of the response shown by GadE immunoblot and gadA/BC Northern experiments in lon+/-. Other in-vivo degradation experiments and GFP fusion studies strongly support additional candidates for proteolytic control within this system, e.g. YdeO and GadW, providing a basis for future studies. In microarray studies and LacZ reportergen fusion studies we identified different groups of genes either controlled by GadE and GadX together or by GadX alone. The complex regulatory architecture could be assessed in the principal pathways and a model was developed, integrating the regulatory mechanisms and dynamics of the acid stress response network.
