Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Stabilisierung von vier strukturell unterschiedlichen Ester-Wirkstoffen (Sagopilone, Drospirenon, Methylprednisolonaceponat [MPA] und Progesteron-Rezeptor-A-selektiver Ligand [PRASL]) in in-vitro-Serumproben von Ratten und Hunden. Dazu wurden die spezifischen Esterasen aus dem Serum von Ratten bzw. Hunden isoliert und identifiziert sowie potente Enzyminhibitoren zur Stabilitätserhöhung gefunden. Für die Isolierung der Sagopilone-, Drospirenon- und MPA-spaltenden Esterasen wurde eine dreistufige, sequenzielle Proteinreinigung (Ionenaustauschchromatografie, Größenausschlusschromatografie und Affinitätschromatografie [zur Abtrennung von Albumin]) von Rattenserum mit Erfolg ausgeführt. Dies deutete (laut Literaturberichten) auf die Anwesenheit von Carboxylesterase (CE) und/oder Butyrylcholinesterase (BChE) in den aktiven Fraktionen hin. Für PRASL wurden mittels einer Affinitätschromatografie zur Isolierung Paraoxonase- (PON-)haltiger Fraktionen (PON-AC) die spaltenden Esterasen (wahrscheinlich PON1) in hoher Ausbeute aus Rattenserum isoliert. Die Drospirenon-spaltenden Esterasen in Hundeserum wurden mittels PON-AC gereinigt, allerdings nur mit geringer Ausbeute und Anreicherung. Die dreistufige Reinigung war für die Isolierung MPA-abbauender Esterasen aus Hundeserum erfolgreich. Daneben lieferte auch die PON-AC Fraktionen mit MPA- spaltender Aktivität aus Hundeserum. Durch Proteinidentifizierung mittels matrix-assisted laser desorption ionization – time of flight – mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) der gereinigten, Sagopilone-spaltenden Fraktionen aus Rattenserum wurde CE 1 gefunden, deren Beteiligung am Abbau sowohl von Sagopilone als auch von Drospirenon und MPA postuliert wurde. In den PRASL- spaltenden Fraktionen der PON-AC von Rattenserum wurden einerseits mittels Western Blot PON1 und andererseits mittels MALDI-TOF-MS Apolipoprotein A-I (Apo A-I) nachgewiesen, wobei die Identifizierung von Apo A-I indirekt auf die Präsenz von PON1 hindeutete. In den für MPA aktiven Fraktionen aus Hundeserum wurde mit Hilfe von liquid chromatography – electrospray ionization – mass spectrometry (LC-ESI-MS) alpha-2-Makroglobulin identifiziert, das wahrscheinlich einen Komplex mit Serinproteasen oder BChE bildete, der Esteraseaktivität aufwies. PON1 wurde in bestimmten PON-AC-Fraktionen aus Hundeserum mittels Western Blot nachgewiesen. Ein Inhibitorscreening wurde mittels ausgesuchter Esterase- und Proteaseinhibitoren durchgeführt. In den isolierten Fraktionen aus Rattenserum sowie in unfraktioniertem Rattenserum wurde konstatiert, dass für den Abbau von Sagopilone wahrscheinlich CE, für den von Drospirenon BChE sowie PON1 und für den von MPA BChE sowie (assoziierte oder gleichzeitig isolierte) Serinproteasen vorwiegend beteiligt waren. Vor allem PON1 war vermutlich für die PRASL-Spaltung in Rattenserum verantwortlich. In Hundeserum wurde der Drospirenonabbau hauptsächlich PON1 und der MPA-Abbau der Amidasefunktion der BChE zugeschrieben. Somit bestätigte das Inhibitorscreening die ersten Annahmen aus der Proteinisolierung und -identifizierung. Es wurden Empfehlungen für die Auswahl und Konzentration von Inhibitoren bezogen auf die Stabilisierung der vier Wirkstoffe in Ratten- und Hundeserum gegeben (vgl. Tabelle 24, Seite 144 der Dissertation). Diese können in weiterführenden in-vitro-Stabilitätsuntersuchungen chemisch verwandter und nicht verwandter Ester-Wirkstoffe in Tier- und Humanblut genutzt werden. Die daraus gewonnenen Erkenntnisse ermöglichen, potente Inhibitoren zur Erhöhung der Stabilität von neu entwickelten Ester-Wirkstoffen in ex-vivo-Blutproben im Rahmen der präklinischen und klinischen Arzneimittelentwicklung frühstmöglich zur Verfügung zu stellen.
The aim of the present study was the stabilization of four structurally different drug ester compounds (sagopilone, drospirenone, methylprednisolone aceponate [MPA], and progesterone-receptor-A-selective ligand [PRASL]) in rat and dog serum samples in vitro. To this end, the specific esterases were isolated from rat and canine serum and subsequently identified. Furthermore, potent inhibitors of these enzymes were found. A three-step purification protocol (including ion-exchange chromatography, size-exclusion chromatography, and affinity chromatography [for removal of albumin]) was successfully used for the isolation of the sagopilone-, drospirenone- and MPA- hydrolyzing esterases from rat serum. In accordance with some literature reports, the presence of carboxylesterase (CE) and/or butyrylcholinesterase (BChE) within the active fractions was suggested. The PRASL-cleaving esterases (presumably paraxonase 1 [PON1]) were isolated from rat serum in high yield by means of an affinity chromatography used for the isolation of PON-containing fractions (PON-AC). The esterases hydrolyzing drospirenone in dog serum were purified by PON-AC, although exhibiting a low activity yield and purification factor. The three-step purification procedure employed on the isolation of MPA-cleaving esterases from canine serum proved to be successful. Besides, MPA-hydrolyzing fractions were obtained by PON-AC. With the help of matrix- assisted laser desorption – time of flight – mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) for protein identification, CE 1 was found in the purified, sagopilone- cleaving fractions from rat serum. The involvement of this esterase in the cleavage of sagopilone as well as of drospirenone and MPA was postulated. In the PRASL-degrading fractions of the PON-AC from rat serum, PON1 was found by Western blot while apolipoprotein A-I (apo A-I) was identified by MALDI-TOF- MS. The identification of apo A-I indirectly demonstrated the presence of PON1 in these fractions. By liquid chromatography – electrospray ionization – mass spectrometry (LC-ESI-MS), alpha-2-macroglobulin (alpha-2-M) was identified in the MPA-cleaving fractions from dog serum, thereby assuming the formation of an esteratically active complex of alpha-2-M with serine proteases or BChE. PON1 was found by Western blot in certain fractions of PON-AC from canine serum. A procedure of screening inhibitors was accomplished with the help of a set of selected esterase and protease inhibitors. By using isolated fractions from rat serum as well as non-fractionated rat serum, CE was assumed to be mainly responsible for the cleavage of sagopilone. It was suggested that drospirenone was primarily cleaved by BChE and PON1 whereas MPA was principally hydrolyzed by BChE and (associated or co-eluting) serine proteases. It appeared that PON1 mainly cleaved PRASL in rat serum. The degradation of drospirenone in dog serum was chiefly ascribed to the activity of PON1 while the MPA cleavage was probably due to the amidase activity of BChE. Thus, the results of the screening confirmed the first suggestions from the protein isolation and identification. Recommendations regarding the choice and concentration of inhibitors for the stabilization of the four drug compounds in rat and dog serum were given (ref. Tabelle 24, p. 144 in the dissertation). These are useful for further in vitro stability studies using chemically related and unrelated drug esters in animal and human blood. In terms of early nonclinical and clinical drug development, the gained experience enables to deliver potent inhibitors for increasing the stability of newly developed drug ester compounds in blood samples ex vivo.
