Hintergrund: Der Organmangel ist nach wie vor der limitierende Faktor in der klinischen Lebertransplantation. Das Konzept der De- und Rezellularisierung von parenchymatösen Organen könnte langfristig die Generierung, autologer und funktioneller Neo-Lebern ermöglichen. Dies soll durch die Rebesiedlung von dezellularisierten porcinen Lebermatrizes mit hepatisch differenzierten, induzierten, pluripotenten Stammzellen erreicht werden. Das Ziel unserer Untersuchung war die Optimierung der Perfusionshomogenität, um dadurch die Schäden der Dezellularisierung zu minimieren. Methoden: Es wurde ein bezüglich der Prozessdauer (Gesamtzeit: 7 h) und Effektivität optimiertes Dezellularisierungsprotokoll für Schweinelebern entwickelt. Dies konnte durch die Anwendung einer Druck-kontrollierten Perfusion über die Leberarterie (120mmHg) und die Pfortader (60mmHg) mit 1% Triton X-100 und 1% Natriumlaurylsulfat erreicht werden. Es wurde der Einfluss oszillierender Umgebungsdruckschwankungen auf den Dezellularisierungsprozess von Schweinelebern (n=19) untersucht. Das eigens für die Erzeugung oszillierender Umgebungsdruckschwankungen entwickelte Gerät imitiert die intraabdominellen Bedingungen während der Respiration, um die Mikroperfusion der Leber zu optimieren und dadurch die Homogenität der Dezellularisierung zu verbessern. Wir analysierten die Effektivität der Perfusionsdezellularisierung mittels makroskopischer Beobachtung, histologischer Färbungen (Hämatoxylin und Eosin [H&E;], Sirius - Rot und Alcian Blau), immunohistologischer Färbungen (Kollagen IV, Laminin und Fibronektin) und biochemischer Beurteilung (DNA-, Kollagen- und Glycosaminoglykangehalt) der dezellularisierten Lebermatrizes. Die Integrität der extrazellulären Matrix (EZM) nach der Dezellularisierung wurde mit Hilfe von Ausguss-Präparaten, sowie der 3D Rekonstruktion einer computertomographischen Untersuchung der Matrix analysiert. Ergebnisse: Es konnte gezeigt werden, dass Lebern, welche mit oszillierenden Umgebungsdruckschwankungen (P(+)) perfundiert wurden, homogener dezellularisiert werden und weniger DNA-Gehalt aufweisen, verglichen mit Lebern welche ohne oszillierende Druckschwankungen (P(-)) perfundiert wurden. Mikroskopisch zeigten Lebern aus der P(-) Gruppe verbliebene Zellnester, während in Lebern der P(+) Gruppe keine Zellen in der EZM mehr sichtbar waren. Der Grad der EZM-Destruktion war höher in Lebern der P(-) Gruppe, obwohl sich die Perfusionsraten und Perfusionsdrücke nicht signifikant zwischen den Gruppen unterschieden. Die immunohistochemischen Färbungen zeigten, dass die wichtigen EZM-Komponenten nach dem Dezellularisierungsprozess erhalten bleiben. Die Ausgusspräparate zeigten ein intaktes Proteingerüst des ehemaligen Gefäßsystems (Pfortader, Leberarterie und Lebervenen), sowie ein erhaltenes Gallengangsproteinnetz. Zusammenfassung: Das hier vorgestellte Protokoll zur Dezellularisierung von porcinen Lebern ist im Vergleich zu bestehenden Protokollen schneller (7h) und effektiver. Die Anwendung oszillierender Umgebungsdruckschwankungen verbessert die Perfusionshomogenität und daraus resultierend das Ergebnis des Dezellularisierungsprozesses.
Background: Organ scarcity is the major limiting factor in clinical liver transplantation programs. Decellularization and recellularization of parenchymal organs may facilitate the generation of autologous functional liver like-organs by repopulation of decellularized porcine liver matrices with induced liver cells. The aim of this study was to optimize the perfusion homogeneity in order to minimize matrix damages caused by the decellularization process. Methods: An accelerated (7 h overall perfusion time) and effective protocol for human-scale liver decellularization by pressure-controlled perfusion with 1% Triton X-100 and 1% sodium dodecyl sulfate via the hepatic artery (120 mmHg) and portal vein (60 mmHg) was developed. Furthermore, the effect of oscillating pressure conditions on pig liver decellularization (n=19) was analyzed. The proprietary perfusion device used to generate these pressure conditions mimics intra-abdominal conditions during respiration to optimize microperfusion within livers and thus optimize the homogeneity of the decellularization process. The efficiency of perfusion decellularization was analyzed by macroscopic observation, histological staining (hematoxylin and eosin [H&E;], Sirius red, and alcian blue), immunohistochemical staining (collagen IV, laminin, and fibronectin), and biochemical assessment (DNA, collagen, and glycosaminoglycans) of decellularized liver matrices. The integrity of the extracellular matrix (ECM) after decellularization was visualized by corrosion casting and three- dimensional computed tomography scanning. Results: Livers perfused under oscillating pressure conditions (P(+)) showed a more homogenous course of decellularization and contained less DNA compared with livers perfused without oscillating pressure conditions (P(-)). Microscopically, livers from the (P(-)) group showed remnant cell clusters, while no cells were found in livers from the (P(+)) group. The grade of disruption of the ECM was higher in livers from the (P(-)) group, although the perfusion rates and pressure did not significantly differ. Immunohistochemical staining revealed that important matrix components were still present after decellularization. Corrosion casting showed an intact vascular (portal vein and hepatic artery) and biliary framework. Conclusion: In summary, the presented protocol for pig liver decellularization is quick (7 h) and effective. The application of oscillating pressure conditions improves the homogeneity of perfusion and thus the outcome of the decellularization process.
