Structure and Function Relationship of the Cardiac Transmembrane Serine Protease Corin: Identification of Key Elements Required for Pro-Atrial Natriuretic Peptide Processing

Abstract

Corin is a cardiac mosaic serine protease that contains an integral transmembrane (TM) domain near the N-terminus. In the extracellular region of corin, there are two Frizzled (Fz) domains, eight low-density lipoprotein receptor (LDLR) repeats, one macrophage scavenger receptor domain, and a trypsin-like serine protease domain at the C-terminus. In previous cell-based studies, corin converted pro-atrial natriuretic peptide (pro ANP) to biologically active ANP, suggesting that corin might be the long-sought pro ANP convertase. This notion is supported by a recent study of corin-deficient mice in which the conversion of pro-ANP to ANP was abolished. In this study, we assessed the requirement of the TM domain and activation cleavage in human corin for pro-ANP processing. We showed that a recombinant soluble corin that consists of only the extracellular region was capable of processing recombinant human pro-ANP in cell-based assays, indicating that the TM domain is not necessary for the biological activity of corin but may enable a mechanism to localize corin at specific sites. In contrast, a mutation at the conserved activation cleavage site, R801A, abolished the function of corin, demonstrating that proteolytic cleavage at the activation site is an essential step in controlling the activity of corin. The above results allowed us to design, express, and purify a mutant soluble corin, EKsolCorin, that contains an enterokinase (EK) recognition sequence at the activation cleavage site. Purified EKsolCorin was activated by EK in a dose-dependent manner. Trypsin- like catalytic activity of EKsolCorin was demonstrated in assays using small- molecule peptide substrates and specific protease inhibitors. In pro-ANP processing assays, purified active EKsolCorin converted recombinant human pro ANP to biologically active ANP in a highly sequence-specific manner. In this study, we also examined the functional importance of the domain structures in the propeptide of corin for pro-ANP processing. We constructed, expressed, and purified a soluble corin, EKshortCorin, that consists of only the protease domain and can also be cleaved by EK. Activated EKshortCorin failed to cleave pro-ANP in a functional assay. In chromogenic substrate-based assays, however, EKshortCorin exhibited catalytic activity, substrate specificity, and sensitivity to protease inhibitors similar to those of EKsolCorin, indicating proper folding of the protease domain in EKshortCorin. Together, these results demonstrated that certain domain structures in the propeptide of corin are required for pro ANP processing, whereas the recognition of small molecule substrates does not depend on the propeptide. We then constructed different series of corin mutants with deletions or point mutations within the propeptide and studied their pro-ANP processing activities. For example, corin mutants lacking either the Fz1 or Fz2 domain exhibited ~40 % and ~32 % activity compared to that of the full-length corin, whereas corin mutants lacking single LDLR repeat 1, 2, 3, 4, or 5 had ~47, ~13, ~50, ~71 and ~80 % activity, respectively. The results of these and additional mutagenesis experiments indicate that the Fz domains and LDLR repeats 1-5 within the propeptide of corin are critical structural elements for corin to recognize its physiological substrate, pro-ANP.

Corin ist eine kardiale Serinprotease, die nahe des N-Terminus eine Transmembran(TM)-Domäne aufweist. Die extrazelluläre Region von Corin umfasst zwei Frizzled(Fz)-verwandte Domänen, acht Low-density Lipoprotein- Rezeptor(LDLR)-Motive, eine Scavenger-Rezeptor-Domäne so wie eine Trypsin- verwandte Serinprotease-Domäne am C Terminus. In früheren Zellkulturstudien wandelte Corin pro-atriales natriuretisches Peptid (pro-ANP) zu biologisch aktivem ANP um, was darauf hindeutete, daß es sich bei Corin um die langgesuchte pro-ANP-Konvertase handeln könnte. Diese Vermutung wurde kürzlich durch eine Corin-Knockout-Studie bestätigt. In dieser Arbeit untersuchten wir die Notwendigkeit der TM-Domäne und der Aktivierungsspaltung von Corin für dessen proteolytische Prozessierung von pro-ANP. Wir zeigten, daß eine rekombinante Corin-Variante, die nur die extrazelluläre Region aufwies, in Zellassays in der Lage war, rekombinantes pro-ANP zu prozessieren, was nahelegte, daß die TM-Domäne für die biologische Aktivität von Corin nicht erforderlich ist. Die Mutation R801A in der konservierten Aktivierungssequenz hingegen, verursachte den Funktionsverlust von Corin. Dadurch wurde demonstriert, daß die proteolytische Spaltung von Arg801-Ile802 ein essentieller Schritt ist, um die Aktivität von Corin zu kontrollieren. Die obigen Ergebnisse führten zu der Konstruktion, Exprimierung und Reinigung einer löslichen Corin-Mutante, EKsolCorin, in der die konservierte Corin- Aktivierungssequenz durch eine Enterokinase(EK)-Erkennungsstelle ersetzt war. Die Aktivierung von gereinigtem EKsolCorin erfolgte konzentrationsabhängig von EK. In Assays mit Peptidsubstraten und Protease-Inhibitoren wies EKsolCorin eine trypsin-ähnliche katalytische Aktivität auf. Außerdem untersuchten wir die Spaltung von pro-ANP und konnten zeigen, daß EKsolCorin pro-ANP sequenzspezifisch prozessierte, wobei biologisch aktives ANP erzeugte wurde. Weiterhin wurde die funktionelle Bedeutung des Corin-Propeptides für die Prozessierung von pro-ANP untersucht. Wir konstruierten, exprimierten und reinigten eine weitere lösliche Corin-Variante, EKshortCorin, die nur aus der Proteasedomäne bestand und ebenfalls eine EK-Erkennungssequenz enthielt. Aktiviertes EKshortCorin war in einem funktionellen Assay nicht fähig, pro-ANP zu spalten. Im Gegensatz dazu, wies EKshortCorin in Assays mit Peptidsubstraten eine ähnliche katalytische Aktivität, Substratspezifität und Empfindlichkeit von EKshortCorin gegenüber Protease-Inhibitoren auf wie EKsolCorin, was auf eine korrekte Proteinfaltung der Proteasedomäne schließen lässt. Diese Ergebnisse demonstrieren, daß bestimmte Domänen innerhalb des Corin-Propeptides für die Prozessierung von pro-ANP erforderlich sind. Daraufhin konstruierten wir mehrere Reihen von Corin-Mutanten mit Deletionen oder Punktmutationen innerhalb des Propeptides und untersuchten deren Aktivität für die Spaltung von pro-ANP. Corin-Mutanten, bei denen z.B. die Fz1- oder die Fz2-Domäne nicht vorhanden war, wiesen eine Aktivität von ~40 % bzw. ~32 % auf, während Corin-Mutanten, in denen das LDLR-Motiv 1, 2, 3, 4 oder 5 fehlte, ~47, ~13, ~50, ~71 bzw. ~80 % Aktivität zeigten. Die Ergebnisse dieser und weiterer Mutagenese-Experimente zeigen, daß die Fz-Domänen und LDLR-Motive 1-5 des Corin-Propeptides kritische Strukturelemente für die Erkennung des physiologischen Substrates pro-ANP durch Corin sind.