Während der Entwicklung des Netzwerkes im zentralen Nervensystem legen die Axone der Neurone große Entfernungen zurück, um an ihre Zielzellen zu gelangen, mit denen sie synaptische Verbindungen eingehen. Das axonale Auswachsen wird von spezifischen Molekülen geleitet, die Richtung und Mobilität des terminalen Wachstumskegels, dem Growth Cone, vorgeben. Plasticity related gene-1 (PRG-1) wurde 2003 als potentielles Molekül entdeckt, dass an der Regulation des axonalen Auswachsens im Hippokampus beteiligt ist. Die Expression beginnt mit dem Embryonaltag 19, einem Zeitpunkt, an dem die Fasertrakte des Hippokampus ausgebildet werden. Außerdem wurde gezeigt, dass das Niveau der mRNA-Transkripte nach einer Kortexläsion hochreguliert wird. In dieser Arbeit wurde die Rolle von PRG-1 an dem axonalen Auswachsen näher untersucht. Dazu wurde mit einer konditionellen PRG-1 KO Maus gearbeitet, die es ermöglichte, den Effekt der Defizient zu analysieren. Für die in vitro Experimente wurde ein entorhinal-hippokampales Ko-Kultur-Modell verwendet, indem grünfluoreszierende Fasern in einem nicht-fluoreszierenden Hippokampus leicht zu detektieren waren. EGFP-exprimierende Mäuse wurden mit der PRG-1 KO Maus gekreuzt und die Ko- Kulturen wurden für 2 verschiedene Experimente verwendet. Die Intensitätsmessungen des Fasertraktes ergaben eine deutlich geringere Innervierung des Hippokampus bei PRG-1 defizienten Axonen und Lebendmessungen (eng: life-imaging) zeigten eine reduzierte Wachstumsgeschwindigkeit solcher Axone. Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass PRG-1 nicht, wie ursprünglich vermutet, auf auswachsenden Axonen lokalisiert ist. Dieser Befund und die Tatsache, dass PRG-1 defiziente Tiere eine Erhöhung der mEPSC Frequenz aufweisen, lässt vermuten, dass der Effekt aktivitätsabhängig sein müsste. Weitere Experimente mit einem organotypischen Kultur-Modell, indem durch die Inhibierung der neuronalen Aktivität der Effekt des geringeren Auswachsens der Axone aufgehoben werden konnte, bestätigten diese Theorie. Dendritenbäume und besonders Spines gelten als Orte der synaptischen Transmission und deren korrekte Entwicklung ist essentiell für die neuronale Informationsweiterleitung. Abnormale Dendritenstrukturen und Veränderungen in der Spinemorphologie werden häufig bei Patienten mit kognitiven Beeinträchtigungen gefunden. Die Expression von PRG-1 erreicht ihren Höhepunkt in der zweiten Lebenswoche. Das ist in der Entwicklung des Gehirns der Zeitpunkt, an dem die Spines gebildet werden (Spinogenese). Außerdem ist das Molekül in der postsynaptischen Dichte glutamaterger Neurone lokalisiert. Diese Tatsachen sprechen für eine Beteiligung von PRG-1 an der Spines- und auch Dendritenbildung, was in dieser Arbeit näher untersucht wurde. Analysen Zusammenfassung -IXeiner EGFP-exprimierenden PRG-1 KO Maus ergaben im Vergleich mit dem Wildtyp für unterschiedliche Alterstufen eine signifikant reduzierte Spindichte im Hippokampus. Dieser Effekt konnte durch in utero und in vitro Experimente auch auf Einzelzellebene bestätigt werden. Analysen von primären hippokampalen Neuronen ergaben auch eine Reduzierung der Dendritenkomplexität in PRG-1 defizienten Zellen. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Überexpression von PRG-1 in PRG-1 KO Tieren den Effekt der PRG-1 Defizienz aufhebt und in neuronalen und nicht-neuronalen Zellen die Bildung von Spines und Filopodien, den Vorläufern von Spines, induziert.
In the central nervous system, in course of network formation, neurons project axons over long distances to target cells, where they form Synapses. Axon outgrowth is conducted by specific guiding cues which determine the direction and the motility of the terminal end tip, the growth cone. Plasticity related gene-1 (PRG-1) was found in 2003 as prospective new molecule facilitating axonal outgrowth. Expression starts at embryonic day 19 (E19), the timepoint, where fibertracts in hippocampus are formed. Furthermore, it could be shown that expression is upregulated after a cortex lesion. In order to elucidate the specific role of PRG-1 on the process of axonal outgrowth, a conditional PRG-1 KO mouse was used in this study. Using a co-culture model of organotypic brain slices, which combines a non-fluorescent hippocampus with an EGFP expressing entorhinal cortex, made it possible to detect outgrowing fibers. EGFP-expressing mice were bred with the PRG-1 KO mouse and prepared co- cultures were used for two different experiments. Intensity measurements of the fibertract showed significant reduced innervation of the hippocampus if PRG-1 is missing in the outgrowing axons and life-imaging experiments exhibit a decreasing outgrowing rate. As it could be shown in this study that PRG-1 is not located on axons as assumed originally and the fact that PRG-1 deficient animals exhibit an increase in mEPSC frequency, it was assumed that the observed effect might be dependant of neuronal activity. This theory was supported by the fact that in a second organotypic culture-system, the effect of decreased outgrowth was inhibited by blockade of calcium channels. As principal sites of excitatory synaptic input, spines and dendritic arbors play a key role in the connectivity of the brain. Their correct development is essential for neuronal information processing, and abnormal dendritic structures and alterations in spine morphology are widespread in neurons of patients with cognitive impairments. As the expression of PRG-1 peaks during the third postnatal week, the time of spineformation and the fact, that PRG-1 is located on postsynaptic density (PSD) of glutamatergic neurons, it was assumed that PRG-1 plays a critical role in the development of dendrites and spines. In this study, the analysis of an EGFP-expressing PRG-1 KO mouse revealed a significant decreased spine density at different timepoints in comparison with the WT. This observation could be confirmed by in utero and in vitro experiment on single cell level. In addition, analysis of primary hippocampal neurons revealed a reduction of dendritic tree complexity. Furthermore, the overexpression of PRG-1 rescue the effect of PRG-1 deficiency in conditional KO mice and induced the formation of spines and filopodia, the precursor of dendritic spines, in neuronal and non-neuronal cells.
