Der in Bakterien ubiquitäre Sekundärbotenstoff c-di-GMP fördert die Biofilmbildung und inhibiert die Motilität [Sondermann et al., 2012]. C-di-GMP wird durch Diguanylatzyklasen (DGC), welche eine GGDEF-Domäne besitzen, synthetisiert und durch spezifische Phosphodiesterasen (PDE), charakterisiert durch eine EAL-Domäne, hydrolysiert. Im Genom des gramnegativen Bakteriums Escherichia coli K-12 (E. coli) sind 29 dieser GGDEF/EAL-Gene kodiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden alle GGDEF/EAL-Domänen-Proteine des Bakteriums E. coli näher untersucht. Mit chromosomalen lacZ-Reportergenfusionen zu den einzelnen GGDEF/EAL-Genen wurde die Expression entlang der Wachstumskurve in Komplexmedium (LB) untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass 22 der 29 GGDEF /EAL-Gene unter diesen Bedingungen exprimiert werden. Die Studie zeigt, dass 50% der GGDEF/EAL-Gene Expression während dem exponentiellen Wachstum zeigen, und dass die anderen 50% eine Stationärphasen-induzierte Expression aufweisen. Dabei steht die Mehrheit der Stationärphasen-induzierten GGDEF/EAL-Gene auch unter der Kontrolle des Stationärphasen-Sigmafaktors RpoS (S). Dieser spielt unter anderem eine wichtige Rolle bei der Biofilmentwicklung und kontrolliert bis zu 10% des E. coli Genoms [Weber et al., 2006]. In dieser Arbeit konnte weiterhin gezeigt werden, dass die Expression von insgesamt vierzehn GGDEF /EAL-Genen durch RpoS (zehn Gene positiv und vier Gene negativ) reguliert wird. Für vier Biofilm-assoziierte und RpoS-abhängige GGDEF/EAL-Gene (ydaM, yciR, yaiC und yoaD) konnte bei der Untersuchung der Expression auf Festmedium eine induzierte Expression und für das Motilitäts-assoziierte EAL-Gen yhjH eine reduzierte Expression nachgewiesen werden. Ein Prozess, der positiv durch c-di-GMP reguliert wird, ist die Produktion der adhäsiven Curli-Fimbrien. Die Expression dieser Fimbrien hängt strikt vom Biofilmregulator CsgD ab und findet nur bei Temperaturen unter 30 °C statt. Pesavento et al. (2008) und Weber et al. (2006) konnten zeigen, dass die GGDEF/EAL-Domänen-Proteinen YdaM, YciR, YegE und YhjH an der Regulation der csgD-Transkription beteiligt sind. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass auch das GGDEF/EAL-Domänen- Protein CsrD die csgD-Transkription und damit die Expression der adhäsiven Curli-Fimbrien beeinflusst. Der positive Einfluss von CsrD auf die csgD- Transkription wurde daraufhin näher untersucht. Bei CsrD ist sowohl die GGDEF- als auch die EAL-Domäne degeneriert. Ein Einfluss auf den zellulären c-di-GMP- Umsatz kann also ausgeschlossen werden. Suzuki et al. (2006) konnten zeigen, dass CsrD durch Bindung den Abbau der kleinen sRNAs CsrB und CsrC fördert. Diese kleinen RNAs sind Teil des Csr-System, welches durch das RNA-bindende Protein CsrA die Motilität fördert und die Biofilmbildung inhibiert. Des Weiteren ist bekannt, dass das csgD-Transkript von fünf kleinen RNAs gebunden wird. Die Bindung der sRNAs hat eine Reprimierung von csgD zur Folge [Boehm &Vogel;, 2012]. Bei der Untersuchung, ob es einen Zusammenhangs zwischen CsrD und den csgD-reprimierenden sRNAs OmrA, OmrB, RprA und McaS gibt, konnte im Rahmen dieser Arbeit mit Hilfe einer chromosomalen lacZ-Reportergenfusion zu csgB, dem ersten Gen des Curli- Strukturoperons, gezeigt werden, dass CsrD und die kleinen RNAs einen additiven Einfluss auf die Curli-Fimbrien- Expression haben. Ein Einfluss des Csr-Systems auf die Curli-Fimbrien- Expression kann jedoch ausgeschlossen werden. Da CsrD sRNAs destabilisieren kann, wurden in einem csrD-defizienten Hintergrund auch die Transkriptmenge und die Stabilität von verschiedenen kleinen RNAs mittels Northern Blot- Analysen untersucht. Die Ergebnisse dieser Studien legen dar, dass CsrD nicht nur CsrB und CsrC, sondern auch weitere kleine RNAs (ArcZ, OmrA, OmrB und RprA) reguliert. Auffällig bei diesen Studien war der stark erhöhte RprA- Gehalt in einem csrD-defizienten Hintergrund. Die Expression der kleine RNA RprA steht unter positiver Kontrolle des Rcs-Phosphorelay-Systems. Das Rcs- Phosphorelay-System spielt, durch die Aktivierung der Kapselsynthesegene und durch die Reprimierung des Masterregulators der flagellaren Kaskade, eine wichtige Rolle bei der Reifung des Biofilms. Mit chromosomalen lacZ- Reportergenfusionen zu verschiedenen Rcs-abhängigen Genen (rprA, bdm und flhDC) konnte gezeigt werden, dass CsrD das Rcs-Phosphorelay-System inhibiert. Die Ergebnisse weisen daraufhin, dass CsrD spezifisch über das RcsB-Homodimer und die kleine RNA RprA auf CsgD wirkt. Die Analyse des genauen Angriffspunktes von CsrD auf das Rcs-Phosphorelay-System ergab, dass in einem csrD-defizienten Hintergrund die Zellen verkürzt sind und dies über die Außenmembrankomponente RcsF wahrgenommen wird. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ein weiterer Regulator des Rcs-Phosphorelay-Systems aufgedeckt werden – der MreBCD-Komplex. Dieser Komplex spielt bei der Zellteilung und bei der Aufrechterhaltung der Zellform eine wichtige Rolle. Die Aktivierung des Rcs- Phosphorelay-Systems über MreBCD erfolgt ebenfalls über die Außenmembrankomponente RcsF, allerdings ohne die Zelllänge dabei zu beeinflussen. Die Transkriptom-Studien von S. Busse (2009) deckten auf, dass RprA und CsgD ein gemeinsames Regulon kontrollieren. Ein weiteres wichtiges Ziel diese Arbeit war die genauere Charakterisierung dieses gemeinsamen Regulons. Die gesamtgenomischen Mikroarray-Analysen zeigen, dass CsgD zum einen RprA-abhängig und –unabhängig Zielgene reguliert und zum anderen sowohl als Protein als auch als mRNA wichtige und unterscheidbare Rollen bei der Regulation seiner Zielgene spielt. Als Protein übernimmt CsgD die Funktion eines Transkriptionsfaktors und als mRNA bindet es verschiedene kleine RNAs, wie RprA, und inhibiert so deren Wirkung. Die Transkriptom-Analysen zu RprA ergaben, dass RprA neben den bekannten Zielen, weitere, wie beispielsweise paaABCD beeinflusst, aber nur, wenn kein csgD-Transkript in der Zelle nachweisbar ist. Die zusätzlichen gesamtgenomischen Mikroarray-Analysen zur c -di-GMP-abhängigen Regulation des Biofilmregulators CsgD bestätigen die Annahme, dass das YdaM/YciR-Kontrollmodul spezifisch CsgD reguliert und dass das YegE/YhjH-Kontrollmodul neben CsgD noch weitere Ziele beeinflusst. Die hier gezeigten Analysen zu CsgD und RprA zeigen die Komplexität und die Wichtigkeit des Transkriptionsfaktor CsgD bei der Regulation der Aktivität kleiner RNAs und der Expression seiner Zielgene auf.
The second messenger c-di-GMP is ubiquitous in bacteria. A high level of c-di- GMP promotes biofilm development and inhibits motility [Sondermann et al., 2012]. This second messenger is synthesized by diguanylate cyclases (dgc), which possess a GGDEF domain, and is hydrolized by phosphodiesterases, which are characterized by an EAL domain. The genome of the gram-negative bacteria Escherichia coli (E. coli) encodes for 29 GGDEF/EAL genes. In this thesis all GGDEF/EAL domain proteins of the enteric bacteria E. coli were analyzed. Using chromosomal lacZ fusions to the GGDEF/EAL genes, the expression was studied along the growth curve. It was shown that all 22 of the 29 GGDEF/EAL genes were expressed in complex media (LB). 50% of the GGDEF/EAL genes were expressed in the exponential growth phase and the other 50% in the stationary phase. The majority of the stationary-induced genes are also under the control of the stress sigma factor RpoS. This factor plays - among other things - an important role in biofilm development. Altogether, RpoS controls approx. 10% of the E. coli genome [Weber et al., 2006]. This thesis shows that RpoS regulates the expression of a total of 14 GGDEF/EAL genes (10 genes were regulated positively and 4 negatively). The expression studies on plates resulted in higher expression of 4 biofilm-associated and RpoS-dependent GGDEF/EAL genes (ydaM, yciR, yaiC and yoaD) and in lower expression of the EAL gene yhjH, which is associated with motility. C-di-GMP positively regulates the production of adhesive curli fimbria. Their expression depends strictly on the biofilm regulator CsgD and on a temperature below 30°C. Pesavento et al. (2008) and Weber et al. (2006) point out, that the GGDEF/EAL domain proteins YdaM, YciR, YegE und YhjH are involved in the regulation of the csgD transcription. In this thesis it was shown that the GGDEF/EAL domain protein CsrD also influences the transcription of csgD and the expression of the adhesive curli fimbria. The positive influence of CsrD in relation to csgD transcription was investigated more closely. CsrD has degenerated GGDEF and EAL domains, therefore any effect on c-di-GMP can be ruled out. The study by Suzuki et al. (2006) indicates that CsrD promotes the degradation of the small RNAs CsrB and CsrC by binding to them. These sRNA are part of the Csr system. Here the RNA binding protein CsrA promotes motility and inhibits biofilm development. Furthermore, it is known that 5 sRNAs can bind to the csgD mRNA. The sRNAs’ binding to the csgD transcript leads to its destabilization [Boehm &Vogel;, 2012]. The possible connection between CsrD and the csgD- repressing sRNAs OmrA, OmrB, RprA and McaS was investigated by a chromosomal lacZ fusion to csgB, the first gene of the structural curli operon. This study demonstrates an additional effect of CsrD and the sRNA on curli expression. Any influence of the Csr system on curli fimbria expression can be ruled out. Since CsrD destabilizes sRNA, the amount and stability of different sRNAs were investigated in a csrD-deficient environment via Northern blot analysis. The results of this study demonstrate that CsrD regulates the amounts of additional small RNAs (ArcZ, OmrA, OmrB und RprA) alongside CsrB and CsrC. Notable in this study is the fact that the amount of RprA increases significantly in a csrD-deficient backround. The expression of the small RNA RprA is under positive control of the Rcs phosphorelay system. The Rcs phosphorelay system is important for the maturation of the biofilm via activation of the capsule synthesis genes and repression of the flagellar cascade’s master regulator. It was demonstrated with chromosomal lacZ fusions to different Rcs-dependent genes (rprA, bdm und flhDC) that the Rcs phosphorelay system is inhibited by CsrD. The results suggest that CsrD acts specifically via the homodimer of RcsB and the small RNA RprA to regulate CsgD. The analysis of the application point of CsrD to the Rcs phosphorelay system resulted in smaller cells in a csrD-deficient backround. The outer membrane component RcsF seems to sense this shortening in a csrD-deficient backround. In this thesis, MreBCD were revealed as other regulators of the Rcs phosphorelay system. The MreBCD complex is important for cell division machinery and maintaining cell shape. The activation of the Rcs phosphorelay system via MreBCD is also realized by the outer membrane component RcsF, but cell length is unaffected. The transcriptom studies by S. Busse (2009) specified a common regulon for CsgD and RprA. Another important goal of this thesis was the analysis of this common regulon. Whole-genome microarray analyses argue that, on the one hand, CsgD regulates targets in both RprA- dependent and -independent manners, and, on the other hand, that CsgD controls its target both as a protein and as mRNA. As a protein CsgD acts as a transcription factor; as mRNA it binds to sRNAs, such as RprA and inhibits their functions. The transcriptom studies on RprA have clearly shown that RprA controls other targets (in addition to its known targets), such as, for example, paaABCD , but only in the absence of csgD mRNA. Further whole-genome microarray analysis of the c-di-GMP control modules of the biofilm regulator CsgD reveal the specificity of the YdaM/YciR control module. The results also show that the YegE/YhjH control module influences other targets in addition to CsgD. The analyses of CsgD and RprA presented here demonstrate the complexity and importance of the transcription factor CsgD in the regulation of sRNA activity and the expression of its targets.
