Die Transplantation ist Therapie der Wahl terminaler Niereninsuffizienz. Trotz guter Ein- jahresraten ist die Langzeitfunktion der Transplantate jedoch unbefriedigend. Hauptur- sache hierfür ist die chronische Allograftnephropathie (CAN). Sie ist einerseits bedingt durch antigen- abhängige Immunreaktionen (akute und chronische Abstoßung); ande- rerseits durch antigen-unabhängige Faktoren, wie den Ischämie-Repferusionsschaden (I/R-Schaden). Zur definitiven Therapie antigen-abhängiger Faktoren wird langfristig die Induktion einer Transplantattoleranz angestrebt. Ein im Tiermodell vielversprechendes Modell hierfür ist der Einsatz monoklonaler Antikörper wie CTLA4-Ig. Unabhängig von einer eventuell erreichbaren Toleranzinduktion bliebe der I/R-Schaden als antigen- unabhängiger Faktor bestehen. Seine mögliche Interaktion mit einer Toleranzinduktion durch CTLA4-Ig und dessen Folgen für Transplantatfunktion und Empfängerüberleben sind bisher nicht beschrieben. Die vorliegende Arbeit untersucht den Einfluss verlängerter Ischämie auf die Nieren- transplantatfunktion und die antigen- abhängige Immunantwort nach Empfängerbehand- lung mit CTLA4-Ig. Im etablierten DA→Lewis Tiermodell starker Histoinkompatibilität (akutes Abstoßungsmodell), wurde ein zweistufiger Versuch durchgeführt: In Stufe I erhielten zwei Empfängergruppen Transplantate nach kurzer oder verlängerter Kalt- ischämie (~20 min vs. 6 h). Beide Gruppen erhielten zur Toleranzinduktion eine Einzel- dosis CTLA4-Ig. Nach 100 Tagen Beobachtungszeit wurden sie geopfert und ihre Leu- kozyten adoptiv auf neue Empfänger übertragen (Stufe II). Die Empfänger der Stufe II erhielten anschließend neue Transplantate mit einheitlich kurzer Ischämie (~20 min). Ihr alleiniger Unterschied bestand im Gruppenursprung der Spenderleukozyten. Nach einer Beobachtungszeit von 20 Tagen wurden die Tiere der Stufe II ebenfalls getötet. In Stufe I wurden das Empfängerüberleben und die Transplantatfunktion anhand von Proteinurie und Kreatinin-Clearance ausgewertet. Am Ende der Beobachtungszeit wur- den die Ersttransplantate histomorphologisch sowie immunhistochemisch hinsichtlich der Expression der Antigene CD4, CD8, und CD25, sowie ED1, OX62 und OX3 unter- sucht. Zusätzlich wurden T-Zellfrequenzen (CD3+, CD4+) und Frequenzen regulatori- scher T-Zellen (CD4+, CD25+) in den transfezierten Milzzellsuspensionen durchflusszy- tometrisch bestimmt. Am Ende des zweiten Beobachtungszeitraumes wurden die Frequenzen von T-Zellen (CD3+, CD4+, CD25+) und DC (OX62+, CD86+, MHC II+) in den Transplantaten sowie peripher in Blut, Milz und Lymphknoten der Empfänger durchflusszytometrisch bestimmt. Eine Unterscheidung von Spender- und Empfänger-APC erfolgte mittels RT1Aab, einem spezifischen Antigen gegen MHC Klasse II (Haplotyp RT1a) auf Zellen des DA- Spenderstammes. In FACS- Mehrfachfärbungen wurden insbesondere die Frequenzun- terschiede regulatorischer T-Zellen (doppeltpositiv: CD4+CD25+) und aktivierter Spen- der-DC (dreifach positiv: OX62+RT1Aab+CD86 oder OX62+RT1Aab+MHC II) ermittelt. Als Indikator der Alloreaktivität wurde die IFN-γ-Synthese CD3+T-Zellen im ELISPOT untersucht. Zur Charakterisierung der T-Zellaktivität (Aktivierung vs. Anergie) wurde zudem die Expression der Zytokine IL-4, IL-6, IL-10 und TNF-α im ELISA gemessen. Lediglich 34% der Versuchstiere von Stufe I überlebten den Beobachtungszeitraum von 100 Tagen. Unerwarteter weise war das Überleben der Empfänger von Transplantaten verlängerter Ischämie signifikant besser als das der Empfänger nach kurzer Ischämie (63,6% vs. 16,7%). Gleichzeitig waren sowohl die Funktionsparameter als auch der hi- stomorphologische Organzustand in der Transplantatgruppe verlängerter Ischämie ten- denziell besser, als in der kurzer Ischämie. Signifikante Unterschiede der Frequenzen der T-Zellsubpopulationen und der DC zeigten sich zwischen keinen Gruppen; weder in den Transfersuspensionen (Stufe I) noch in den Organen der Zweitempfänger (Stufe II). Die relativen Frequenzen waren in beiden Gruppen beider Stufen vergleichbar und blie- ben von einer verlängerten Ischämie unbeeinflusst (~20 min vs. 6 h). Lediglich die ab- solute Anzahl CD3+ T-Zellen war nach Zweittransplantation (Stufe II) in Gruppe II/2 tendenziell erhöht. Diese Tiere erhielten zuvor Spenderleukozyten von Erstempfängern eines Organs mit verlängerter Ischämie. Auch T-Zell-Alloreaktivität (ELISPOT) und die Zytokinmuster (ELISA) zeigten keine qualitativen Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen der beiden Stufen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine verlängerte Ischämie kei- nen nachteiligen Einfluss auf Transplantatfunktion und Überleben nach Empfängerbe- handlung mit CTLA4-Ig bei der Nierentransplantation hat. Ein Einfluss auf die Frequen- zen und Aktivierungsgrade von CD3+ T-Zellen und Dendritischen Zellen, als Kenngrö- ßen antigen-abhängiger Immunantwort, konnte nicht festgestellt werden.
Transplantation is the therapy of choice for end-stage kidney failure. Despite improvements, long-term graft survival is still poor. The main cause for long- term graft loss is Chronic Allograft Nephropathy (CAN), caused by both antigen-dependent immune reactions (acute and chronic rejection) and antigen- independent factors, such as the ischemia reperfusion injury (I/R injury). Induction of graft tolerance would represent a definite therapy for antigen- dependent immune responses. Despite experimental progress tolerance is still not realized in humans. Experimental tolerance protocols have been almost exclusively tested in optimal individuals receiving organs from optimal donors without considering antigen-independent factors as age, brain death or I/R injury. The CTLA4-Ig fusion protein has shown to be a promising agent for tolerance induction in animal models. Here the influence of prolonged cold ischemia on kidney allograft function and antigen-dependent immune responses after host treatment with CTLA4-Ig was examined. A two step procedure was conducted in the established DA→Lewis model of strong histoincompatibility (acute rejection): In step I two groups of hosts received grafts after either short or prolonged ischemia (~20 min vs. 6 h). For tolerance induction hosts of both groups were treated with a single dose of CTLA4-Ig. After 100 days hosts organs were recovered and splenocytes were adoptively transferred to sublethally irradiated naive Lewis hosts (step II). These animals subsequently received DA grafts after an uniformly short ischemia (~20 min) and without further immunosuppression. After 20 days organs of hosts from step II were recovered for analysis. Survival and graft function in step I were analysed based on proteinuria and creatinine clearance. Histopathology of kidney grafts was assessed by H&E; staining and cellular infiltratres evaluated by immunohistology using monoclonal antibodies specific for CD4, CD8, CD25, ED1, OX62 and OX3. Additionally frequencies of T cells (CD3+, CD4+) and regulatory T cells (CD4+, CD25+) in the transferred spleen cell suspension were determined by flow cytometry (FACS). At the end of step II, frequencies of T cells and Dendritic cells (OX62+, CD86+, MHC II+) were determined in the same manner in grafts, blood, spleens, and lymph nodes of secondary hosts. Multiplex FACS staining revealed frequency differences regarding regulatory T cells (CD4+CD25+) and activated donor DC’s (OX62+RT1Aab+CD86 or OX62+RT1Aab+MHC II). Frequencies of alloreactive T cells were determined in secondary recipients using a rat IFN-γ ELISPOT assay. The cytokine production (IL-4, IL-6, IL-10 and TNF-α) was determined by ELISA. Only 34% of animals in step I survived the observation period of 100 days. Surprisingly, survival of hosts with grafts exposed to an extended ischemia was significantly better than survival of hosts with grafts exposed to short ischemia (63,6% vs. 16,7%). At the same time function and morphology of grafts exposed to prolonged ischemia tended to be better than those exposed to short ischemia. Transferred T cell numbers as well as relative frequencies of T cell subpopulations and DC’s in step II were almost comparable in both groups independent of the initial cold ischemic time. No differences were observed regarding T cell alloreactivity (ELISPOT) and cytokine patterns (ELISA) between the groups. The results demonstrated that prolongation of cold ischemia did not influence the effects of CTLA4-Ig treatment on graft survival and function . Moreover, frequencies and the degree of activation of CD3+ T cells or DC’s as indicators of an antigen-dependent immune reaction did not differ in both groups after the adoptive cell transfer.
