Mitochondria are placed at the crossroad of the cellular demands and activities due to their major role in supply of cellular energy and global Ca2+ signaling. Ca2+ entering the cytosol is shuttled by mitochondria: it is rapidly taken up via a mitochondrial Ca2+ uniporter and slowly extruded via a mitochondrial Na+/Ca2+ exchanger. While Ca2+ uptake shares common properties in diverse cell-types, Ca2+ extrusion mechanisms are different. This transmitochondrial Ca2+ transfer partially shapes the cytosolic Ca2+ signals, altering activation patterns of Ca2+-dependent proteins, including Ca2+ transporters, residing nearby. Consequently, mitochondrial Ca2+ shuttling modifies different Ca2+-dependent functions in various cell types. The role of the mitochondrial Ca2+ signaling in glial cells, closely participating in brain signaling in physiology and pathology, remains, however, poorly understood. The recent identification of the mitochondrial exchanger NCLX provided me with the possibility to devise the molecular tools to control its expression and activity. Here, I investigated the role of NCLX in shaping glial mitochondrial and cytosolic Ca2+ responses and assessed how NCLX activity is linked to astroglial and microglial function in vitro. For this purpose I combined RNAi knockdown of NCLX expression or pharmacological inhibition by the benzothiazepine compound CGP37157 with cellular and mitochondrial Ca2+ imaging of murine primary astrocytes and microglia. Cytosolic Ca2+ levels were monitored from cells loaded with Ca2+-sensitive dyes Fluo-4 AM or Fura-2 AM. Mitochondrial Ca2+ changes were recorded from cells transfected with Ca2+-sensitive protein, specifically targeted to the mitochondrial matrix, mitochondrial ratiometric pericam. Immunoblot analysis of organelle-enriched fractions from murine primary cultured astrocytes and microglia showed that NCLX is targeted to the mitochondria. ATP-induced cytosolic Ca2+ responses in astrocytes and microglia evoked mitochondrial Ca2+ transients, indicating that mitochondria participate in glial Ca2+ signaling. Silencing NCLX expression in astrocytes inhibited mitochondrial Ca2+ extrusion and enhanced the net mitochondrial Ca2+ uptake, indicating that NCLX mediates mitochondrial Ca2+ efflux. Silencing or pharmacological blockade of NCLX activity diminished the biphasic, ATP-evoked cytosolic Ca2+ responses in astrocytes and microglia or complement C5a-induced Ca2+ transients in microglia. In microglia the reduction in Ca2+ answers was primarily due to the loss of the delayed component of the response, while in astrocytes the reduction was similarly contributed by the decrease in the amplitude and the time of the response. Moreover, in both types of glia, inhibition of NCLX activity significantly reduced Ca2+ entry via store-operated Ca2+ channels on the plasma membrane. These effects suggest that there is a functional interaction between the mitochondria, ER and plasma membrane, shaping glial Ca2+ responses and that NCLX is a critical component in this crosstalk in both astrocytes and microglia. Pharmacological inhibition of NCLX in microglia resulted in modification of Ca2+-dependent functions. It significantly reduced ATP-stimulated chemotaxis and attenuated the LPS-evoked secretion of IL-6, a cytokine involved in the inflammation process, and elevated basal levels of the chemokine MCP-1. However, NCLX inhibition did not affect other Ca2+-dependent functions in microglia, like TNFα secretion, NO and ROS release. Remarkably, NCLX knockdown in astrocytes was followed by almost complete elimination of the secretion of the major transmitter in the brain, glutamate, and a marked inhibition of astrocytic wound healing and proliferation capacity. However, NCLX knockdown did not significantly alter the speed of the intercellular astrocyte Ca2+ wave propagation. In conclusion, NCLX is the mitochondrial Na+/Ca2+exchanger in glial cells, and its activity affects glial Ca2+ homeostasis, in particularly, the major Ca2+ entry pathway, SOC. In microglia NCLX function via its participation in cellular Ca2+ homeostasis is connected to tuning the inflammatory profile and migratory properties of these cells. In astrocytes, NCLX appears to be a critical element in the crosstalk between mitochondria, ER and plasma membrane, thereby shaping cytoplasmic Ca2+ transients, required for a diverse array of astrocyte activities.
Mitochondrien sind ein Zellkompartiment, welches eine wichtige Schlüsselrolle für die Energieversorgung der Zelle sowie in globalen Kalziumsignalwegen darstellt. Kalzium-Ionen (Ca2+), die in das Cytosol der Zelle gelangen, werden durch Mitochondrien weiterverteilt: sie werden schnell über einen mitochondrialen Ca2+ Uniporter aufgenommen und langsam über einen mitochondrialen Na+/Ca2+-Austauscher abgegeben. Während die Ca2+-Aufnahme in diversen Zelltypen ähnliche Eigenschaften aufweist, sind die Extrusionsmechanismen unterschiedlich. Dieser transmitochondriale Ca2+-Transfer moduliert partiell die intrazellulären Ca2+-Signale, verändert die Aktivierungsmuster Ca2+-abhängiger Proteine, einschließlich der sich in der Nähe der Mitochondrien befindlichen Ca2+-Transporter. Folglich verändert der unterschiedliche mitochondriale Ca2+-Transfer verschiedene Ca2+-abhängige Funktionen in verschiedenen Zelltypen. Die Rolle des mitochondrialen Ca2+ in Gliazellen, welche unter physiologischen und pathologischen Bedingungen an Signalweiterleitungen im Gehirn beteiligt sind, ist bis jetzt wenig verstanden. Durch die kürzliche Identifizierung des mitochondrialen Ionentransporters NCLX war es mir möglich, die Expression und Aktivität des Kanals zu studieren. In dieser Arbeit habe ich die Rolle des Ionentransporters NCLX in der Modulierung mitochondrialer und zytosolischer Ca2+-Antworten sowie den Effekt von NCLX Aktivität auf astrogliale und mikrogliale Funktionen in vitro untersucht. Hierfür habe ich NCLX über die RNA-Interferenz-Technik oder pharmakologisch mithilfe der Benzothiazepinverbindung CGP37157 inhibiert. Anschließend habe ich sowohl zelluläres als auch mitochondriales Ca2+-Imaging an murinen primären Astrozyten und Mikroglia durchgeführt. Intrazelluläre Ca2+-Level wurden mithilfe der Ca2+-sensitiven Farbstoffe Fluo-4 AM oder Fura-2 AM bestimmt. Für die Analyse der mitochondrialen Ca2+-Veränderungen wurden die Zellen mit einem mitochondrialen Ca2+-sensitiven Protein (Pericam) transfiziert. Immunoblot-Analysen von verschiedenen Organellfraktionen aus murinen primären kultivierten Astrozyten und Mikroglia zeigten, dass NCLX mitochondrial exprimiert ist. ATP-induzierte zytosolische Ca2+-Antworten in Astrozyten und Mikroglia riefen einen mitochondrialen Ca2+-Einstrom hervor. Dies weist darauf hin, dass Mitochondrien an glialen Ca2+-Signalwegen beteiligt sind. Ein Silencing der NCLX Expression in Astrozyten verhindert den mitochondrialen Ca2+-Ausstrom und erhöht die mitochondriale Netto- Ca2+-Aufnahme. Daher liegt die Annahme nahe, dass NCLX den mitochondrialen Ca2+-Ausstrom vermittelt. Silencing oder pharmakologische Blockade der NCLX - Aktivität vermindert weiterhin ATP-evozierte, bipasische intrazelluläre Ca2+-Antworten in Astrozyten und Mikroglia oder Komplement C5a-induzierte Ca2+-Einströme in Mikroglia. In Mikroglia-Zellen ergab sich die Reduktion der kumulativen Ca2+-Antworten in erster Linie aus der Verringerung der langsamen Reaktionskomponente. In Astrozyten hingegen trugen sowohl eine Abnahme in der Amplitude als auch in der Zeit der Reaktion zur Verminderung der Ca2+-Antworten bei. Darüber hinaus führt eine Hemmung der NCLX-Aktivität in beiden Arten von Gliazellen zu einem erheblich reduzierten Ca2+-Einstrom über speicherregulierte Ca2+-Kanäle (SOC) auf der Plasmamembran. Diese Effekte weisen darauf hin, dass es eine funktionelle Interaktion zwischen den Mitochondrien, dem ER und der Plasmamembran bei der Modulierung glialer Ca2+-Antworten gibt und dass NCLX eine wichtige Komponente in dieser Interaktion in sowohl Astrozyten als auch Mikroglia ist. Pharmakologische Inhibierung von NCLX in Mikroglia führte zu einer Veränderung von Ca2+-abhängigen Funktionen. Es reduzierte signifikant die ATP-stimulierte Chemotaxis und führte zu einer Abschwächung der LPS-vermittelten Sekretion von IL-6, einem Zytokin, welches an Entzündungsprozessen beteiligt ist, sowie zu einem erhöhten basalen Level des Chemokins MCP-1. Allerdings hatte eine Inhibierung von NCLX keinen Einfluss auf andere Ca2+-abhängige Funktionen in Mikroglia, wie TNFα-Sekretion oder NO- und ROS-Freisetzung. Bemerkenswerterweise wurde nach Knockdown von NCLX in Astrozyten die Ausschüttung des Hauptneurotransmitters des Gehirns, Glutamat, fast vollständig inhibiert. Weiterhin konnte ich ich eine deutliche Hemmung der astrozytären Wundheilung sowie der Proliferationskapazität messen. Allerdings verändert der NCLX-Knockdown die Geschwindigkeit der Ausbreitung von interzellulären astrozytären Ca2+ Wellen nicht wesentlich. Zusammenfassend kann ich sagen, dass NCLX der mitochondriale Na+/Ca2+-Austauscher in Gliazellen ist. Seine Aktivität beeinflusst die gliale Ca2+-Homöostase, insbesondere den Hauptweg des Ca2+-Einstroms in die Zelle über SOC. In Mikroglia ist NCLX an der zellulären Ca2+ Homöostase beteiligt und moduliert dadurch das inflammatorische Profil sowie die Migrationseigenschaften der Zellen. In Astrozyten scheint NCLX ein kritisches Element in der Interaktion zwischen den Mitochondrien, dem ER und der Plasmamembran zu sein, wodurch zytoplasmatische Ca2+ Einströme moduliert werden, was für vielfältige astrozytäre Aktivitäten erforderlich ist.
