Proteasome sind zelluläre Proteasen, involviert in den Abbau von einer Vielzahl zellulärer Proteine. Das 20S Proteasom ist ein zylindrischer 28-mer Protein-Komplex, welcher aus zwei außenständigen sieben-Ringen (α-Ringe; Substrateingang) und zwei innenliegenden sieben-Ringen (β-Ringe; katalytisches Zentrum) besteht. Zahlreiche Studien haben den Beweis erbracht, dass das 20S Proteasom Peptide in verschiedenen Längen sowie komplette denaturierte Polypeptidketten abbaut. Jedoch konnte bis jetzt nicht der Beweis erbracht werden, dass das 20S Proteasom fähig ist, ein oberflächengebundenes, immobilisiertes Peptid zu prozessieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, die erstmalig den proteasomalen Verdau trägerfixierter Peptide über den massenspektrometrischen Nachweis in Lösung gegangener Peptidfragmente charakterisiert. Initial wurden unterschiedliche Träger (Gold, Silizium und glass-beads) getestet und neuartige Funktionalisierungsmethoden für eine optimale Peptidanbindung etabliert. Hierbei wurde jede Funktionalisierungsstufe mittels verschiedener optischer und elektrochemischer Verfahren charakterisiert. Schließlich wurde der proteolytische Verdau der kovalent fixierten Peptide mittels LC-MS/MS analysiert und kartographiert. Während der Methodenentwicklung zeigte sich, dass die glass-beads aufgrund der signifikant geringer einzusetzenden Peptidmenge und der resultierenden absoluten Peptidstoffmenge am besten geeignet sind. Mit diesem optimierten Versuchsaufbau konnte erstmalig das Abbauverhalten verschiedener fixierter Peptide durch das Proteasom mittels nanoLC-MS/MS nachgewiesen werden. Zum ersten Mal konnte gezeigt werden, dass das Proteasom N-Terminal fixierte Substrate mit einer erheblich beschleunigten Abbaurate prozessieren kann im Vergleich zum gelösten Substrat. Des Weiteren konnte ein verändertes Schnittmuster im Vergleich zum gelösten Substrat beobachtet werden, das jedoch teilweise mit dem bekannten, in Lösung verdauten Substrats, übereinstimmt. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse darauf hin, dass auch die in den Lösungsraum orientierten Termini membranständiger Proteine ubiquitin- unabhängig durch das 20S Proteasom degradiert werden könnten. Die von uns etablierte Methode legt außerdem den Grundstein für die Entwicklung von semi- automatischen Verfahren für die schnelle Identifizierung von Abbauprodukten oder anderen enzymatischen Prozessen.
Proteasomes are cellular proteases involved in the degradation of numerous cellular proteins. The 20S proteasome is a cylindrical 28-mer protein complex composed of two outer heptameric α-rings forming the entrance for the protein substrate and two inner heptameric β-rings carrying the catalytic sites. Numerous in vitro studies have provided evidence that the 20S proteasome may degrade peptides of various lengths and even unfolded full-length polypeptide chains. However, a direct demonstration that the 20S proteasome may also cleave surface-attached immobilized peptides is lacking so far. In the present work a method was developed which characterized the proteasomale digestion of solid-phase bound peptides by peptide fragments in the aqueous phase. Initially different surfaces (gold, silicon and glass-beads) were selected and novel functionalization methods for an optimal peptide fixation were established. During this procedure, every functionalization step was characterized by different optical and electrochemistry techniques. Finally, the protolytical fragments of the proteasome digestion of the covalent fixed peptides were analyzed by LC-MS/MS and map. Based on the preliminary results glass-beads showed to be the eligible candidate for the further experiments due to the significant fewer amounts of peptides required for the surface fixation and yield of coupled peptides. With this optimized setup we were for the first time able to demonstrate by means of nanoLC-MS/MS the proteasomal digestion of different surface fixed peptides. Our results clearly demonstrated that the proteasome is able to degrade N-terminal fixed peptides with a much higher degradation rate as compared to the soluble substrate. Furthermore, a modified cleavage pattern could be observed between surface- fixed or in solution proteasomale digestion. However, some digestion products are detectable in both approaches. In summary, this finding supports our initial hypothesis that proteasomes may be able to directly degrade segments of membranebound proteins protruding into the aqueous phase. Furthermore, this study lays the foundation for the development of semi-automatic methods to identify very rapidly proteasomale digestion products.
