Miyoshi myopathy (MM), limb girdle muscular dystrophy 2B (LGMD2B) and distal anterior compartment myopathy (DACM) are rare autosomal recessive muscle disorders caused by mutations in dysferlin. They are encompassed by the term dysferlinopathy and affect the proximal and/or distal muscles of the limbs. Patients usually become wheelchair bound within 15 years of disease onset due to progressive muscle degeneration, weakness and atrophy. No treatment is available. The dysferlin gene spans over 150 kb of genomic DNA in chromosome 2p13 and comprises 55 exons that form a coding sequence of 6.2 kb. Dysferlin is a 237 kDa protein of the ferlin family. It is expressed in many tissues, but more strongly in muscle, where it is found in mature myofibers and to some extent also in satellite cells and myoblasts. It has important roles in membrane repair and in maintaining the transverse tubule structure in myofibers. Besides alterations of these two functions, defects in dysferlin cause increased inflammatory attack to muscle fibers thereby enhancing the muscle pathology. Muscle regeneration relies on muscle stem cells, called satellite cells, and their progeny of muscle precursors, the myoblasts. Upon muscle injury caused by severe trauma or muscle disorders, they are capable of extensive proliferation to repair the damaged tissue. Satellite cells are marked by the expression of the transcription factor Pax7, they can be isolated based on specific surface markers and have a robust engraftment potential when transplanted into regenerating muscles. Therefore, autologous or allogeneic satellite cell and myoblast transplantation are envisioned as promising therapeutic alternatives. Given that a single gene is causative for dysferlinopathy, gene therapy also holds great promise. However, the large size of the full-length dysferlin coding sequence represents a challenge for gene transfer approaches because most viral vectors used in gene therapy have a lower cargo capacity. Sleeping Beauty transposon is a non-viral bi-component vector system consisting of a transposon DNA sequence and a transposase protein. The transposase excises the transposon from a donor plasmid and integrates it into the target genome. Since the transposon can be engineered to carry any sequence of interest, Sleeping Beauty is very valuable as a genetic tool for stable gene transfer and has been widely used in gene therapy. Sleeping Beauty system can be used to integrate transgenes up to ~8 kb with high efficiency. It is therefore well-suited for delivery of full- length dysferlin. In this work, I developed a non-viral cell-based gene therapy approach for dysferlinopathy. Using Sleeping Beauty transposon, I transferred the full-length human dysferlin cDNA into dysferlin deficient H2K A/J mouse myoblasts, leading to restoration of dysferlin protein expression in vitro. I transplanted the corrected myoblasts into dysferlin deficient Scid/blAJ mice following local irradiation of the recipient muscles. This step was necessary to ablate the endogenous satellite cells and promote engraftment of the transplanted cells. I found up to ~90 dysferlin expressing myofibers 3 and 6 weeks post-transplantation. Inducing regeneration in the recipient muscles simultaneously to cell transplantation by injection of cardiotoxin, a snake venom toxin that causes acute damage to myofibers, further enhanced engraftment of the donor cells. In muscles treated with cardiotoxin in addition to irradiation, I found up to ~1000 donor-derived myofibers 3 and 6 weeks after grafting, which were present almost along the entire length of the muscles. Moreover, I found numerous Pax7+ cells in the vicinity of donor- derived myofibers in the grafted muscles. Given that recipient muscles were irradiated prior to grafting, this suggests that donor myoblasts were able to repopulate the host satellite cell compartment upon transplantation. Engraftment as satellite cells would ensure long-term contribution of donor- derived cells to muscle regeneration. These results show the feasibility of long-term full-length dysferlin reconstitution in skeletal muscle through ex vivo gene transfer with Sleeping Beauty.
Miyoshi Myopathie (MM), Gliedergürteldystrophie Typ 2B (engl. limb girdle muscular dystrophy 2B, LGMD2B) und die DACM (distal anterior compartment myopathy) sind seltene, autosomal rezessiv vererbte Krankheiten, die durch Mutationen im Dysferlin-Gen verursacht werden. Diese muskulären Erkrankungen werden unter dem Begriff Dysferlinopathie zusammengefasst und betreffen die proximale und/oder die distale Muskulatur der Extremitäten. Durch eine zunehmende Schwächung und Atrophie der Muskeln sind Patienten normalerweise bereits 15 Jahre nach Krankheitsbeginn an den Rollstuhl gebunden. Behandlungsmöglichkeiten gibt es hier keine. Das Dysferlin-Gen umfasst einen 150 kb-Bereich der genomischen DNA auf Chromosom 2p13 und beinhaltet 55 Exons mit einer kodierenden Sequenz von 6,2 kb. Dysferlin ist ein 237 kDa Protein der Ferlinfamilie. Es ist in vielen Geweben vorhanden, vor allem im Muskelgewebe, wo es in ausgereiften Muskelfasern, aber auch in Satellitenzellen und Myoblasten exprimiert wird. Dysferlin spielt eine wichtige Rolle bei der Membranreparatur und der Aufrechterhaltung der T-Tubuli Struktur in den Muskelfasern. Auβer dem erhöht sich durch ein defektes Dysferlinprotein die Entzündungsanfälligkeit der Muskelfasern. Die Regenerationsfähigkeit von Muskeln beruht auf den Muskelstammzellen (Satellitenzellen) und ihren Abkömmlingen, den Muskelvorläuferzellen (Myoblasten). Bei Muskelverletzungen, z.B. durch schwere Verwundungen oder durch Muskelerkrankungen, vermehren sich diese Zellen extensiv um das geschädigte Gewebe zu reparieren. Satellitenzellen sind durch die Expression des Transkriptionsfaktors Pax7 gekennzeichnet. Ihre Isolation basiert auf spezifischen Oberflächenmarkern. Zudem haben sie ein hohes Anwachspotential, wenn sie in sich regenerierendes Muskelgewebe tranplantiert werden. Deshalb gilt die autologe oder allogene Transplantation von Satellitenzellen oder Myoblasten als vielversprechende therapeutische Alternative. Da Dysferlinopathien durch ein einzelnes Gen verursacht werden, ist zudem die Gentherapie hier sehr erfolgversprechend. Allerdings werden Gentransferversuche durch die Gröβe der kodierenden Dysferlinsequenz erschwert, da die meisten viralen Vektoren, welche für Gentherapiezwecke benutzt werden, eine zu geringe Ladungskapazität besitzen. Das Sleeping Beauty Transposon ist ein nicht-virales 2-Komponenten Vektorsystem, welches aus der DNA Sequenz des Transposons und einem Transposase Protein besteht. Die Transposase schneidet das Transposon aus dem Donorplasmid heraus und integriert es in das Zielgenom. Da das Transposon so verändert werden kann, dass es jede Zielsequenz beinhalten kann, ist Sleeping Beauty ein sehr wichtiges, nicht-virales, genetisches Werkzeug, das einen stabilen Gentransfer ermöglicht und deshalb häufig in der Gentherapie verwendet wird. Durch das Sleeping Beauty System kann ein bis zu 8 kb groβes Transgen effizient integriert werden. Damit ist es auch für die Integration des vollständigen Dysferlin-Gens sehr gut geeignet. Im Rahmen dieser Arbeit habe ich eine Methode entwickelt, welche einen nicht-viralen zellbasierten Ansatz zur Gentherapie von Dysferlinopathien ermöglicht. Durch Nutzung des Sleeping Beauty Transposons ist es mir gelungen, die vollständige humane Dysferlin cDNA-Sequenz in Dysferlin-defiziente H2K A/J Myoblasten der Maus zu transferieren und die Dysferlinexpression in vitro wieder herzustellen. Die so korrigierten Myoblasten habe ich in Dysferlin-defiziente Scid/blAJ Mäuse transplantiert, in denen der Empfängermuskel zuvor lokal bestrahlt wurde. Dieser Schritt war notwendig, um die Anzahl der endogenen Satellitenzellen zu verringern und das Anwachsen der transplantierten Zellen zu fördern. 3-6 Wochen nach der Transplantation konnte ich eine Dysferlinexpression in bis zu 90 Muskelfasern nachweisen. Eine gleichzeitig zur Transplantation stattfindende Injektion des Zellgiftes Cardiotoxin führte zu einem wesentlich verbesserten Anwachsen der Donorzellen. Muskeln, welche zusätzlich zur Bestrahlung noch mit Cardiotoxin geschädigt wurden, wiesen 3 bis 6 Wochen nach der Transplantation bis zu 1000 Dysferlin exprimierende Muskelfasern auf. Zudem konnte ich in den transplantierten Muskeln eine Vielzahl von Pax7 positiven Zellen in der Umgebung der von den Spenderzellen abgeleiteten Myofibrillen identifizieren. Da der Empfängermuskel vor der Transplantation bestrahlt wurde, deutet dieses darauf hin, dass das Satellitenzellkompartiment des Empfängermuskels nach der Transplantation wieder neu besiedelt wurde. Das Anwachsen der Myoblasten als Satellitenzellen würde daher einen dauerhaften Beitrag der Spenderzellen zur Regeneration des Muskels belegen. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine Rekonstruktion des vollständigen Dysferlin Proteins in Skelettmuskeln durch Sleeping Beauty vermittelten Gentransfer möglich ist.
