Der Na+-K+-2Cl--Kotransporter (NKCC2) der dicken aufsteigenden Henle-Schleife (thick ascending limb; TAL) ist essentiell für die Harnkonzentrierung und den Elektrolythaushalt. Das antidiuretische Hormon ADH aktiviert den Transporter über Stimulation seiner luminalen Translokation und Phosphorylierung an konservierten N-terminalen Threoninresten (T96, T101, and T114). Währenddessen wird NKCC2 in Lipid rafts eingeschlossen. Eine Deaktivierung des Transporters erfolgt über seine Dephosphorylierung und Internalisierung. Hierbei fungiert die Clathrin-abhängige Endozytose als eine der Hauptrouten. In der vorliegenden Arbeit wurde der Hypothese nachgegangen, dass die aktivierende, N-terminale Phosphorylierung von NKCC2 über Hemmung seiner Clathrin-abhängigen Internalisierung den Transporter in der Plasmamembran stabilisieren könnte. Eine Charakterisierung der Verteilung von NKCC2 in der apikalen Membran von TAL-Zellen zeigte eine anteilige Ko-Lokalisaton mit Clathrin in Non-raft Regionen, während der phosphorylierte Transporter sich vorwiegend in durch Flotillin-1 markierten Lipid rafts befand und kaum mit Clathrin ko-lokalisiert war. Eine pharmakologische Inhibition der Clathrin-abhängigen Endozytose mittels Chlorpromazin in kultivierten TAL-Zellen führte zur signifikanten Steigerung der NKCC2-Oberflächenexpression und untermauerte somit die Rolle dieser Internalisierungsroute im Kontext der NKCC2-Funktion. Die Untersuchung von N-terminalen phospho- sowie dephospho-NKCC2 Mutanten mittels Ko- Immunpräzipitation und GST-pull-down Assays deuteten darauf hin, dass die Phosphorylierung des Transporters seine N-terminale Bindung mit Clathrin inhibiert. Weitere Evidenz dafür wurde durch Stimulation von ADH-defizienten Brattleboro-Ratten mit dem ADH-Agonist dDAVP erbracht: die durch dDAVP induzierte Phosphorylierung von NKCC2 ging mit einer Abschwächung seiner Assoziation mit Clathrin einher. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit darauf hin, dass die N-terminale Phosphorylierung von NKCC2 seine Clathrin-abhängige Internalisierung und somit seine Oberflächenexpression und Funktion moduliert.
The Na+-K+-2Cl--cotransporter (NKCC2) of the thick ascending limb (TAL) plays an essential role in the urinary concentration and renal salt handling. Vasopressin stimulates NKCC2 activity by inducing its apical trafficking and phosphorylation at functionally relevant N-terminal residues (T96, T101, and T114 of rat NKCC2). The phosphorylated and thereby activated transporter is chiefly distributed in lipid raft membrane microdomains, whereas its deactivation is associated with dephosphorylation and clathrin-mediated internalization. Whether NKCC2 phosphorylation state affects its trafficking or surface expression was unclear. Therefore, the aim of this study was to evaluate effects of NKCC2 phosphorylation on its clathrin-mediated endocytosis. Evaluation of the topographic NKCC2 distribution in the apical membrane of TAL cells using antibodies that regnognize native NKCC2 or its phosphorylated form showed substantial co-localization of both signals with Lipid rafts markers such as flotillin-1 and a partial co-localization of native NKCC2 with clathrin in Non-raft membrane regions was detected. Pharmacological inhibition of clathrin-mediated endocytosis with Chlorpromazin in cultured TAL cells rapidly increased NKCC2 surface expression, suggesting an essential role of this internalization route for the transporters’ membrane turnover and function. Co-immunoprecipitation and GST Pulldown assays using N-terminal NKCC2 mutants mimicking its constitutive (de)phosphorylation, suggested that the N-terminal phosphorylation of the transporter may attenuate its association with clathrin-coated pits. Stimulation of NKCC2 phosphorylation in vivo by treating AVP-deficient Brattleboro rats with the V2 receptor agonist, dDAVP, reduced the interaction of the transporter with clathrin and increased its surface expression, thus providing further evidence for an interference between NKCC2 phosphorylation and its internalization rate. In summary, the results of this study suggest that N-terminal phosphorylation of NKCC2 attenuates its clathrin-mediated internalization and facilitates therefore its function by stabilizing the transporter in the luminal membrane.
