Cytokinins are important plant hormones and as such they trigger a wide range of responses in plants. Cytokinins are perceived by membrane-located histidine kinases and transduce the signal via the His-to-Asp phosphorelay system, which also includes histidine phosphotransfer proteins and response regulators. The cytokinin signal transduction system is well understood in higher plants, but knowledge about the molecular principles of cytokinin signal transduction in basal land plants is limited. The first part of this project therefore investigated the first step of signal transduction in the basal land plant P. patens. Experiments on the functionality of the bioinformatically predicted P. patens cytokinin receptors showed that PpCHK1 and PpCHK2 bind cytokinin, and that PpCHK3 converts cytokinin presence into a two-component system output in E. coli cells. Transient expression in tobacco also suggests that the P. patens cytokinin receptors PpCHK1, PpCHK2 and PpCHK3 could fulfill a similar function to the A. thaliana cytokinin receptors, concluded mainly from its localization. Furthermore, the A. thaliana ahk2 ahk3 double knockout mutant was used to analyze the complementation capacity of two cytokinin receptors on the whole plant level. This complementation experiment showed that both tested P. patens receptors (PpCHK1 and PpCHK2) have the ability to function as cytokinin receptors in A. thaliana. Generated mutant lines of P. patens, transformed with GFP fusion constructs of PpCHK1 or PpCHK2, showed changes in chloroplast distribution or shape in transgenic lines of both receptors and both fusion orientations, which led to the conclusion that the P. patens cytokinin receptors might have a function related to chloroplast distribution and shape. Altogether, it was shown that PpCHK1 and PpCHK2 are functional cytokinin receptors. While their function in P. patens seems involved in chloroplast development, these receptors are able to fulfill a function analogous to cytokinin receptors in A. thaliana, but a role in chloroplast development was not apparent in A. thaliana. The objective of the second part of the project was to increase our understanding of the evolution of the cytokinin signaling system. For analysis, a domain-based approach was chosen. To gain insights into the origin and evolution of the cytokinin regulatory system, key components of the cytokinin signaling pathway and of cytokinin metabolism were identified in the genomes or EST data of different species ranging from bacteria and algae to modern land plants. The first domain investigated was the CHASE domain, which is part of the cytokinin sensing receptor. The phylogenetic tree of all CHASE domains found in the dataset showed a clade containing well known cytokinin receptors. Surprisingly, this clade had a sister clade of eight P. patens and one M. polymorpha CHASE domains. These new potential cytokinin receptors were also identified by an analysis of the other protein domains in the cytokinin receptors. Experimental investigation of two representatives from the newly identified potential cytokinin receptors showed their functionality in cytokinin binding and signal transduction into a TCS output. Additionally, there is evidence for the most C-terminal domain of the cytokinin receptor, the response regulator (RR) domain in charophyte algae, which could possibly be part of a receptor protein. The results imply that the domains necessary for the formation of a cytokinin receptor protein were present in the ancestors of the land plant lineage and also in cyanobacteria. These domains were assembled into a receptor protein with the domain architecture of the classical cytokinin receptors in progenitors of charophyte algae and land plants. Furthermore, the obtained results indicate that type-C RR proteins might derive from receptor proteins. Regarding the downstream signaling components from the cytokinin signaling system, single-domain proteins were identified among the three RR protein groups (type-A, type-B and pseudo RR proteins), which contrasts with the current guidelines on how to group RR proteins. Analysis of the metabolism proteins indicated that charophytes might encode biosynthesis genes in their genomes, while the classical cytokinin catabolism gene (cytokinin oxidase/dehydrogenase, CKX) was absent from chlorophyte genomes and charophyte EST collections. Altogether this analysis accumulated hints on the existence of a potential cytokinin signaling system in charophyte algae, while P. patens remains the earliest-diverging plant to also incorporate a full set of cytokinin metabolism enzymes according to current data.
Cytokinine sind wichtige Pflanzenhormone und als solche haben sie verschiedene Auswirkungen auf die Pflanze. Cytokinine werden von membranständigen Histidinekinasen erkannt und das Signal wird mittels eines His-zu-Asp Phosphorelays weitergeleitet. Die Weiterleitung involviert anschließend ein Phosphatresttransfer von einem Histidinphospho-transferprotein zu einem Responseregulatorprotein. Während das Cytokininsignaltrans-duktionssystem in höheren Pflanzen gut erforscht ist, sind Informationen über das Cytokinin- signaltransduktionssystem in primitiven Landpflanzen rar. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde deshalb der erste Schritt der Cytokininsignaltransduktion in der basalen Landpflanze P. patens untersucht. Untersuchungen der Funktionalität der bioinformatisch vorhergesagten Cytokininrezeptoren zeigen, dass PpCHK1 und PpCHK2 Cytokinin binden und das PpCHK3, in E. coli die Präsenz von Cytokinin in ein Signal des Zwei-Komponenten-Systems konvertieren kann. Die transiente Expression von P. patens Cytokininrezeptoren in Tabak legt nahe, dass PpCHK1, PpCHK2 und PpCHK3 eine ähnliche Funktion wie die A. thaliana Cytokininrezeptoren haben könnten, da sich ihre Lokalisation konserviert darstellt. Anschließend wurde die Komplementationskapazität von zwei P. patens Cytokininrezeptoren auf die A. thaliana ahk2 ahk3 doppel knockout Mutante untersucht. In diesem Experiment zeigen die beiden P. patens Cytokininrezeptoren (PpCHK1 und PpCHK2), dass sie als Cytokininrezeptoren in A. thaliana wirken können. Hergestellte P. patens Mutanten, transformiert mit GFP-fusions Konstrukten von PpCHK1 oder PpCHK2 zeigten veränderte Chloroplastenform oder -verteilung in transgenen Pflanzen beider Fusionsrichtungen und führten zu der Schlussfolgerung, dass die P. patens Cytokinin-rezeptoren in P. patens möglicherweise eine Funktion während dieser Prozesse haben. Zusammengenommen wurde gezeigt, dass P. patens Cytokininrezeptoren PpCHK1 und PpCHK2 funktionelle Cytokininrezeptoren sind. Während sie in P. patens an der Entwicklung von Chloroplasten beteiligt sein könnten, können sie in A. thaliana die Funktion nativer Cytokininrezeptoren übernehmen, aber eine Rolle bei der Chloroplastenentwicklung konnte in A. thaliana nicht festgestellt werden. Zweck des zweiten Teils dieser Arbeit war es das Wissen über die Evolution des Cytokininsignaltransduktionssystems zu erweitern. Zur Untersuchung wurde ein Ansatz basierend auf Proteindomänen gewählt. Um Einsichten in die Entstehung und die Evolution des regulatorischen Systems von Cytokinin zu erlangen, wurden Kernkomponenten des Cytokininsignaltransduktionssystems und des Cytokinin-Metabolismus in dem vorliegenden Datensatz, aus Genom- und Expressed Sequence Tag (EST)-Daten verschiedener Spezies von Bakterien über Algen bis hin zu modernen Landpflanzen identifiziert. Zuerst wurde die ligandenbindende CHASE Domäne der Cytokininrezeptoren untersucht. Der phylogenetische Baum aller CHASE Domänen zeigte eine Klade bekannter Cytokininrezeptoren. Überraschenderweise hatte diese Klade eine Schwesterklade, welche acht P. patens und eine M. polymorpha CHASE Domäne beinhaltete. Diese neuen, potentiellen Cytokininrezeptoren wurden auch von weiteren Domänen, die Teil eines Cytokininrezeptors sind, identifiziert. Die experimentelle Beschreibung zweier Repräsentanten aus der Klade der neuen, potentiellen Cytokininrezeptoren zeigte die Funktionalität dieser Rezeptoren bei der Bindung von Cytokinin und die Signalweiterleitung bei Cytokinin Präsenz in ein Signal des Zwei-Komponenten-Systems. Außerdem wurde die C-terminale Domäne des Cytokininrezeptors, die Responseregulator Domäne in Charophyceae identifiziert, die möglicherweise Teil eines Cytokininrezeptors sein könnte. Die generierten Ergebnisse weisen darauf hin, dass alle Domänen zur Zusammensetzung eines Cytokininrezeptors bereits in den Vorfahren der Landpflanzen und in Cyanobakterien vorhanden waren. Diese Domänen könnten zu einem Protein mit der Domänen-Architektur klassischer Cytokininrezeptoren in Vorläufern von Charophyceae und Landpflanzen assembliert worden sein. Weiterhin weisen die Ergebnisse darauf hin, dass Typ-C Responseregulator Proteine möglicherweise von Rezeptoren abstammen. Bezüglich der weiteren Signalkomponenten des Cytokininsignaltransduktionssystems wurden Proteine mit nur einer Proteindomäne in allen drei Gruppen der Responseregulator Proteine (Typ-A, Typ-B und Pseudo Responseregulator Proteine) identifiziert und stellen damit geltenden Richtlinien zur Einteilung dieser Gruppen in Frage. Die Analyse der Proteine, beteiligt am Metabolismus von Cytokinin legte nahe, dass Charophyceae Gene zur Biosynthese von Cytokinin im Genom enthalten könnten, während klassische Katabolismus Gene (wie die Cytokininoxidase/-dehydrogenase) in Chlorophyceae Genomen und Charophyceae EST-Kollektionen nicht vorhanden waren. Zusammengenommen wurden Hinweise auf die Existenz eines potentiellen Cytokininsignaltransduktionssystems in Charophyceae gesammelt, während P. patens, nach derzeitigem Stand, die am frühsten divergierende Landpflanze bleibt, die auch ein komplettes Set von Cytokinin Metabolismus Genen codiert.
