Cowpox virus (CPXV) belongs to the genus Orthopoxvirus in the family Poxviridae. CPXV is a large complex virus that infects a broad range of animals and can cause zoonotic infections. CPXV has the largest genome and the most complete set of genes among the orthopoxviruses, therefore CPXV has become a popular model for studying poxvirus genetics and pathogenesis. The bacterial artificial chromosome (BAC) clone of CPXV Brighton Red (BR) strain constructed in a previous study has enabled us to efficiently modify the CPXV genome for studying the virus. In this thesis, a complete knockout library of the BAC clone of CPXV BR was generated and characterized. These mutants allow high-throughput and systematic assessments of the roles of single CPXV genes in virus infection and replication, as well as virus host range determination. Out of 183 mutant BAC clone, 109 mutant viruses were successfully reconstituted, suggesting that the 109 corresponding genes are not necessary for virus replication while the other 74 ORFs are essential. As all mutant BAC clones contain dual fluorescent markers for early and late viral gene expression virus reconstitution can be monitored easily. Thus it was possible to discriminate between different phenotypes, such as no plaque formation, formation of ‘red fluorescence-only’ plaques, and formation of wild-type-like ’red and green fluorescence’ plaques. The knockout library was also applied for another systematic screening, the identification of CPXV proteins involved in inducing hemorrhagic lesions (“red pocks”) on chicken chorioallantoic membranes (CAM). Although all orthopoxviruses can infect chicken CAM, only CPXV and rabbit poxvirus induce red pocks. Other orthopoxviruses produce non- hemorrhagic lesions (“white pocks”). Cytokine response modifier A (CrmA) of CPXV proved to be necessary but not sufficient for the induction of red pocks. Another study showed that kelch-like proteins might also be involved in the hemorrhagic phenotype. By screening all the single knockout mutants and kelch- like deletion mutants, 10 proteins that are required for the formation of hemorrhagic lesions were identified and kelch-like proteins were proved to be not responsible for inducing red pocks. In conclusion, the first complete targeted BAC knockout library of a large DNA virus was generated in this thesis. Reconstitution of mutant BAC clones provided important information about the importance of single viral genes for viral replication, and led to the identification of new phenotypes of CPXV. By screening CAM infection of the reconstituted mutant viruses, 10 proteins that are involved in inducing hemorrhagic lesions on chicken CAM was identified. This discovery provided novel insights into the mechanisms of the formation of hemorrhagic lesions. In the future, this knockout library can be used for more high-throughput screens to study various biological characteristics of CPXV.
Kuhpocken (CPXV) gehören zur Gattung der Orthopockenviren in der Familie Poxviridae. CPXV ist ein großes komplexes Virus, das in der Lage ist ein breites Speziesspektrum zu infizieren und Zoonosen zu verursachen. CPXV hat das größte und vollständigste Genom unter den Orthopockenviren und ist deshalb ein beliebtes Model zur Untersuchung der Genetik und Pathogenese von Pockenviren geworden. Ein BAC (bacterial artificial chromosome)-Klon von CPXV, der in einer früheren Studie erstellt wurde, ermöglichte die effiziente Modifikation des CPXV Genoms um das Virus zu studieren. In der hier vorgestellten Arbeit haben wurde eine vollständige Einzelgen-Knockout Bibliothek auf Basis des CPXV-BAC-Klons erstellt und charakterisiert. Die resultierenden Mutanten ermöglichen systematische Hochdurchsatzuntersuchungen der Rolle einzelner CPXV-Gene bei viraler Infektion, Replikation und der Festlegung des Wirtspektrums. Von 183 Mutanten konnten 109 mutierte Viren erfolgreich rekonstituiert werden, was darauf hinweist, dass diese 109 Gene, im Gegensatz zu den verbleibenden 74 Genen, für die Virusreplikation nicht essentiell sind. Alle mutierten BAC-Klone enthielten zwei Fluoreszenzmarker für frühe und späte virale Genexpression, was es uns ermöglichte neue Rekonstitutionsphänotypen in Zellkultur zu beschreiben. Darüber hinaus wurde die Bibliothek auch auf einen anderen Phänotyp hin systematisch untersucht, die Bildung von hämorrhagischen Läsionen („Rote Pocken“) auf chorioallantoischen Membranen von Hühnereiern (CAM). Obwohl alle Orthopockenviren Hühner-CAMs infizieren können, induzieren nur CPXV und Kaninchenpocken „Rote Pocken“, während alle anderen Orthopocken nur nichthämorrhagische Pocken („Weiße Pocken“) hervorrufen. Das CrmA-Gen („Cytokine response modifier A“) der Kuhpocken wurde als notwendig, aber nicht hinreichend für die Induktion von Roten Pocken bestätigt. Andere Studien haben gezeigt, dass die Kelch-ähnlichen Proteine möglicherweise an der Bildung dieses Phänotyps beteiligt sind. Durch einen Screen aller Mutanten sowie von Klech-Deletionsmutanten waren wir in der Lage 10 Proteine zu identifizieren, die für die Ausbildung hämorrhagischer Läsionen notwendig sind und konnten zeigen, dass Kelch-ähnliche Proteine nicht an der Bildung von Roten Pocken beteiligt sind.
