Sialic acids are essential components of membrane glycoconjugates. They are responsible for the interaction, structure and functionality of all deuterostome cells and have major functions in cellular processes and diseases. The key enzyme of the biosynthesis of sialic acid is the bifunctional UDP-N-acetylglucosamine-2-epimerase/N-acetylmannosamine kinase (GNE) that transforms UDP-N-acetylglucosamine to N-acetylmannosamine-6-phosphate and has a direct impact on the sialylation of the cell surface. In this thesis three high resolution crystal structures of the recombinant human acetylmannosamine kinase domain (hMNK) from GNE are presented. hMNK converts N-acetylmannosamine to N-acetylmannosamine-6-phosphate, a precursor of sialic acid, and has a direct impact on the sialylation of the cell surface, which is of medical interest because sialylation of tumor cell surface glycans is at a higher level than that of healthy cells. The complexes formed by hMNK with its substrate N-acetylmannosamine (ManNAc), with ManNAc and ADP, and with ManNAc-6-phosphate and ADP, show structural details of reaction educt and product. hMNK belongs to the ROK family of proteins, and this study presents the first human member of this family in complex with its cognate substrate. The interactions between hMNK and ManNAc explain the high substrate specificity of hMNK and suggest a key active site residue, Asp517, that was mutated and shown to be crucial for enzymatic activity. Since the structure of the complex formed between hMNK and ManNAc also indicated the structural properties of a possible inhibitor, we synthesized ManNAc-6-O-acetate that proved to be a modest inhibitor and may be taken as lead for more potent inhibitors that could open novel ways for sialic acid research, glycan bioengineering and cancer therapy.
Sialinsäuren (Sias) sind essentielle Komponenten der Membran-Glycokonjugate. Sias sind zuständig für die Interaktion, Struktur und Funktionalität aller Deuterostomia-Zellen und spielen eine wichtige Rolle bei zahlreichen zellulären Prozessen und Krankheiten. Das Schlüsselenzym der Sialinsäurebiosynthese ist die bifunktionelle UDP-N-Acetylglukosamin-2-Epimerase/N-Acetylmannosamin Kinase (GNE), die UDP-N-Acetylglucosamin in N-Acetylmannosamin-6-phosphate umwandelt und einen direkten Impakt auf der Sialylierung der Zelloberfläche hat. Dies ist von medizinischem Interesse, denn Tumorzellen weisen eine höhere Sialylierung der Zelloberflächeglykane im Vergleich zu gesunden Zellen auf. In der vorliegenden Dissertation, werden drei hochaufgelöste Kristallstrukturen der rekombinanten menschlichen N-acetyl Mannosamine Kinase Domäne (hMNK) von GNE präsentiert. hMNK wandelt N-Acetylmannosamin in N-Acetylmannosamin-6-Phosphat (eine Vorläufersubstanz von Sias) um. Die Komplexe zwischen hMNK und ihrem natürlichen Substrate N-Acetylmannosamin (ManNAc), zwischen hMNK, ManNAc und ADP und zwischen hMNK, ManNAc-6-Phosphat and ADP zeigen strukturelle Details von Reaktions-edukt und –produkt. hMNK gehört zur ROK Proteinfamilie und diese Arbeit präsentiert die erste Struktur eines menschlichen Proteins dieser Familie im Komplex mit seinem Substrat. Die Interaktionen zwischen hMNK und ManNAc erklären die hohe Substratspezifität von hMNK und schlagen einen aktiven Aminosäuren Rest vor, Asp517, der mutiert wurde und eine entscheidende Rolle für die Katalyse zeigte. Da die Struktur des Komplexes hMNK/ManNAc die strukturellen Eigenschaften von einem möglichen Inhibitor vorgeschlagen hatte, wurde ManNAc-6-O-Acetat synthetisiert und zeigte eine schwache Inhibition. Diese Verbindung kann daher genommen werden als Startpunkt für die Herstellung von neuen und besseren hMNK- Inhibitoren, die guten Alternativen, sowohl für Sialinsäure Forschung, als auch für Glykan Bioengineering und die Krebs Therapie bieten sollten.
