Der Glucocorticoidrezeptor (GR) ist ein wichtiger Regulator der Insulinsensitivität und Glucosetoleranz. Da bereits für die Histon Deacetylase 6 (HDAC6) gezeigt wurde, dass diese das Hitzeschockprotein 90 (HSP90) deacetyliert und dieses in Abhängigkeit seines Acetylierungsstatus die korrekte Ausbildung einer ligandenbindungsfähigen Konformation des GR vermittelt, wurde mit dieser Arbeit der Effekt von HDAC6 auf die GR Funktion im Glucosestoffwechsel in vivo und in vitro untersucht. Für diese Studie wurde sowohl mit primären Hepatozyten von Wildtyp und HDAC6-defizienten Mäusen, als auch mit den entsprechenden chronisch Vehikel- als auch Dexamethason- behandelten Mäusen gearbeitet. Zusätzlich wurden Untersuchungen mit verschiedenen HDAC Inhibitoren in vitro in H4IIE Rattenhepatomzellen durchgeführt. Die primären Hepatozyten wurden mit einem GR-eGFP-Konstrukt transfiziert, bevor sie mit Dexamethason stimuliert wurden, und es zeigte sich in der fluoreszenzmikroskopischen Analyse eine eingeschränkte nukleäre Translokationsfähigkeit des GR in den HDAC6-defizienten verglichen mit den Wildtyp Hepatozyten. Dieser Effekt wurde durch die Western Blot Analyse des GR-Proteingehalts in den nukleären sowie zytoplasmatischen Fraktionen der Lebern der entsprechenden chronisch Dexamethason- sowie Vehikel-behandelten Mäuse bestätigt. Aus diesen Lebern wurde ebenfalls RNA gewonnen und diese hinsichtlich der Genexpression des gesamten Genoms mit einem Microarray untersucht. Die Analyse bestätigte, dass HDAC6 kein Transkriptionsregulator ist, aber die GR-vermittelte Genregulation einschränkt. Die Expression der bestimmenden Gene der hepatischen Gluconeogenese Phosphoenolpyruvat Carboxykinase (PEPCK), Glucose 6-Phosphatase (G6P), Pyruvatcarboxylase (PCX) und Fructose 1,6-Bisphosphatase (FBP) wurden mittels qPCR untersucht: alle vier Gene wurden im Wildtyp signifikant durch Dexamethason induziert. Im Gegensatz dazu war die Dexamethason-induzierte gesteigerte RNA -Expression von G6P und FBP in den HDAC6-defizienten Mäusen völlig aufgehoben und die Induktion der PEPCK und PCX Genexpression durch fehlendes HDAC6 signifikant gegenüber den Dexamethason-behandelten Wildtypmäusen reduziert; es bestand allerdings immer noch eine signifikante Induktion der PEPCK und PCX verglichen mit den Vehikel-behandelten HDAC6-Knockout Mäusen. Zusätzlich wurde dieser Effekt in vitro in H4IIE Zellen durch den Einsatz von Tubacin, einem selektiven HDAC6 Inhibitor, bestätigt. Hier vermochte Tubacin die Dexamethason-induzierte G6P und PEPCK Genexpression signifikant einzuschränken. Wie die Ergebnisse der Untersuchungen in Dexamethason- stimulierten Wildtyp und HDAC6 Knockout Hepatozyten ergaben, reicht die durch HDAC6-Defizienz bedingte Reduktion der Expressionsinduktion dieser Gene aus um auch die entsprechende Glucosefreisetzung signifikant zu vermindern. In Wildtyp Mäusen resultiert die chronische Injektion Dexamethasons in einer deutlichen Glucoseintoleranz, Insulinresistenz und Hyperinsulinämie. In HDAC6 Knockout Mäusen hingegen war die Glucocorticoid-induzierte Glucoseintoleranz vollständig aufgehoben. Des Weiteren entwickelte sich keine Hyperinsulinämie in den HDAC6-defizienten Tieren und auch die GR-vermittelte Insulinresistenz war merklich verbessert, wie sich in einem Insulintoleranztest heraus stellte. Diesen Ergebnissen entsprechend, scheint es angemessen, HDAC6 als wichtigen Regulator der Funktion des GR im Glucosestoffwechsel zu bezeichnen. HDAC6-Defizienz bedingt eine Beeinträchtigung der hepatischen nukleären GR Translokation, führt somit zu einer eingeschränkten Aktivierung der Gluconeogenese und schlussendlich zu einer Verbesserung der Glucocorticoid- induzierten diabetogenen Stoffwechsellage. Die Modulation der GR Funktion durch selektive HDAC6 Inhibition könnte daher eine Möglichkeit zur therapeutischen Einflussnahme darstellen.
The glucocorticoid receptor (GR) is an important regulator of insulin sensitivity and glucose tolerance. In view of the fact that in vitro the histone deacetylase 6 (HDAC6) has been shown to be a major deacetylase of heat shock protein 90 (HSP90) which in turn is mediating correct folding of the GR and subsequent ligand interaction depending on HSP90 acetylation status the effect of HDAC6 on GR function in a metabolic context in vivo and in vitro was investigated. For this study primary hepatocytes isolated from wildtype and HDAC6-deficient mice as well as chronically dexamethasone- and vehicle-treated wildtype and HDAC6 knockout mice (3 weeks i.p. injection; 1mg/kg body weight) were used for experiments. Additionally experiments in H4IIE rat hepatoma cells with different HDAC inhibitors were performed. Primary hepatocytes isolated from wildtype and HDAC6 knockout mice were transfected with a GR-eGFP plasmid before stimulation with dexamethasone revealing attenuated glucocorticoid-induced nuclear translocation of the GR in HDAC6-deficient hepatocytes by analysis with fluorescence microscopy. This effect was confirmed by evaluating GR protein content in cytoplasmic and nuclear fractions of livers of the corresponding chronically dexamethasone- and vehicle-treated mice. Isolated mRNA from the livers of the animals was used to conduct a whole genome microarray (Affymetrix®) confirming that HDAC6 does not act as a transcriptional regulator but attenuates GR-mediated gene regulation. The expression of major hepatic gluconeogenic genes such as phosphoenol pyruvatecarboxykinase (PEPCK), glucose-6-phosphatase (G6P), pyruvate carboxylase (PCX) and fructose-1,6-bisphosphatase (FBP) was evaluated by qPCR: all genes were significantly upregulated in livers of wildtype mice after dexamethasone treatment. In contrast, dex-induced G6P and FBP upregulation was absent in HDAC6-deficient mice and PEPCK and PCX induction by dexamethasone was significantly reduced compared to dexamethasone treated wildtype mice although significantly induced compared to vehicle treated HDAC6 knockout mice. In addition this effect of HDAC6 was confirmed by the use of tubacin as selective HDAC6-inhibitor in H4IIE hepatoma cells. Here tubacin potently blocked dexamethasone-induced gene expression of G6P and PEPCK. Reduced gene expression of some of the analyzed genes is evidently sufficient to reduce glucose output in primary hepatocytes as dexamethasone stimulation in wildtype and HDAC6-deficient hepatocytes revealed. In wildtype mice chronic dexamethasone injection resulted in a marked glucose intolerance, insulin resistance and hyperinsulinemia. In HDAC6 knockout mice glucocorticoid-induced glucose intolerance was completely abolished. Furthermore, dexamethasone- mediated hyperinsulinemia in wildtype mice did not occur in HDAC-deficient mice and GR-mediated insulin resistance in these mice was ameliorated ascertained by an insulin tolerance test. Along the results of this study it deems appropriate to say HDAC6 resembles an important regulator of metabolic GR-function for HDAC6 deficiency leads to impaired hepatic GR-translocation which in turn leads to attenuation of gluconeogenesis and eventually to an amelioration of glucocorticoid-induced metabolic derangement. Modulation of GR-function by selective HDAC6 inhibition may therefore provide an opportunity for therapeutic intervention.
