Fluorine has proven to be a versatile tool in pharmaceutical chemistry and materials science, due to its unique physicochemical properties. The incorporation of C-F bonds into peptides and proteins has also been shown to have desirable effects on thermal and metabolic stability, as well as protein- protein interactions and self-assembly. However, because our understanding of the impact of fluorine within a native protein environment is still very limited, the rational design of such unnatural biopolymers remains impractical. In this doctoral study, aminobutyric acid and two of its fluorinated analogues were site-specifically incorporated into basic (bovine) trypsin inhibitor (BPTI) and the properties of these novel mutants were characterized. Two approaches were taken to introduce the unntaural amino acids into the P1 position of BPTI: in vitro translation-based amber stop codon suppression and total chemical synthesis. In the first case, tRNAs bearing the unnatural amino acid were successfully generated by means of chemical aminoacylation, but the extremely low efficiency of in vitro translation made it necessary to abandon this route to the mutant inhibitors. Total chemical synthesis based on solid phase peptide synthesis and native chemical ligation enabled sufficient quantities of the unnatural BPTI variants to be obtained for further study. Their global structure and thermal stability were characterized by circular dichroism. The inhibitor activity of each was determined by means of a well-established assay. In contrast to the hydrocarbon parent side chain, the fluorinated BPTI variants retain thermal stability and inhibitor activity. High-resolution crystal structures of the three synthetic BPTI variants in complex with β-trypsin show very little overall structural perturbation with the exception of two new water molecules that fill in the space created by the removal of the native lysine side chain at the P1 position. In the fluorine-containing structures, the B-factors of these two water molecules are significantly lower than the values seen in the aminobutyric acid structure, indicating that fluorine-induced noncovalent interactions within an extensive H-bond network account for the observed restoration of inhibition.
Aufgrund seiner einzigartigen Eigenschaften erweist sich Fluor als ein vielfältiges Werkzeug in der pharmazeutischen Chemie und in den Materialwissenschaften. Der Einbau der C-F Bindung in Proteine zeigt vielseitige, erstrebenswerte Einflüsse auf die Thermostabilität, metabolische Stabilität, Protein-Protein-Interaktionen und Selbstassoziation. Allerdings ist das aktuelle Verständnis der Eigenschaften von Fluor innerhalb einer natürlichen Proteinumgebung noch sehr eingeschränkt, d. h. dass ein rationales Proteinengineering mit fluorierten Aminosäuren zum gezielten Einfluss auf die strukturellen Eigenschaften und Funktionalitäten bisher noch nicht möglich ist. Im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit wurden die α-Aminobuttersäure und zwei ihrer fluorierten Analoga in den pankreatischen Trypsin-Inhibitor (BPTI) ortsspezifisch eingebaut. Die Wirksamkeiten der mutierten BPTI wurden charakterisiert. Zwei Methoden wurden für den Einbau der nicht-natürlichen Aminosäuren in P1-Position des BPTI eingesetzt. In der ersten Methode wurde eine Suppressor-tRNAPheAUC aus Hefe-Zellen mittels semi-synthetischer Methode mit nicht-natürlichen Aminosäuren beladen. Die Proteinexpression erfolgt anschließend mittels Zell-freier Proteinexpression. Jedoch war die Produktion der mutierten BPTI-Proteine wegen geringer Effizienz der Zell-freien Expression nicht erfolgreich. Deshalb wurden verschiedene mutierte BPTI- Analoga mittels der chemischen Totalsynthese, die auf der Festphasenpeptidesynthese zusammen mit natürlicher chemischer Ligation basiert, synthetisiert. Die globale Struktur und die thermische Stabilität der synthetisierten BPTI-Analoga wurden mittels Circulardichroismus charakterisiert. Im Gegensatz zu den nicht-fluorierten BPTI-Proteinen zeigten die fluorierten BPTI-Analoga retinierte thermische Stabilität und ein ähnliches Bindungsvermögen zu Proteasen. Die hochaufgelösten Kristallstrukturen der BPTI-Trypsin-Komplexe zeigten die minimale strukturelle Perturbation von nicht-natürlichen Seitenketten bei der S1-Position, mit Ausnahme der Einlagerung von zwei Wassermolekülen. Die niedrigen B-Faktoren dieser zwei Wassermoleküle in fluorierten Komplexen geben Einblick darin, dass das Inhibitionsvermögen der fluorierten BPTI-Analoga von einem Fluor- induzierten Wasserstoff-Brücken-Netzwerk in der S1-Bindungstasche unterstützt wird.
