Surfactant Protein B (SP-B) ist ein in Typ-II-Zellen der Lunge gebildetes 8 kDa schweres Protein, das für die Funktion des Surfactants und damit für die Lungenfunktion äußerst bedeutsam ist. Ein SP-B Gehalt von unter 50% des normalen Gehaltes führt in humanen Lungen und Tiermodellen zu einer reduzierten Surfactantfunktion. Es ist bekannt, daß der Gehalt von SP-B mRNA in Lungen individuell unterschiedlich ist und es liegt die Vermutung nahe, daß dieser Umstand genetisch determiniert ist. Innerhalb des SP-B Gens wurden bisher zahlreiche Polymorphismen beschrieben. Untersuchungen über Polymorphismen im Bereich der regulatorischen Elemente des SP-B Gens, der sog. 5’-flankierenden Region, wurden bisher jedoch nicht demonstriert. Wir suchten daher nach Mutationen in der 5’-flankierenden Region des SP-B Gens und konnten eine Punktmutation in der Consensussequenz des am weitesten stromabwärts gelegenen TTF-1 Bindungselementes der Enhancerregion von SP-B charakterisieren. Diese Punktmutation ist an Position -384 vor Transkriptionsbeginn lokalisiert. In einem kleinen Patientenkollektiv (n=53) zeigte sich bei 15 Patienten (28%) eine heterozygote Mutation, bei einem Patienten (2%) konnte eine Homozygotie identifiziert werden. Zur Untersuchung der funtktionellen Bedeutung der Punktmutation führten wir EMSA-Versuche mit nukleären Extrakten aus H441 Zellen durch. Dabei zeigte sich eine reduzierte Bindungsaktivität der mutierten Sequenz gegenüber der Wildtypsequenz. In Reportergenassays mit einem Luciferasereportergen in transfizierten H441 Zellen zeigte sich eine etwa 50%ige Reduktion der Transkriptionsaktivität des Mutationskonstruktes gegenüber dem Wildtypkonstrukt. Die Stimulation durch Retinsäure führte zu einer erhöhten Reportergenaktivität beider Konstrukte. Allerdings zeigte das Mutationskonstrukt gegenüber dem Wildtypkonstrukt nach wie vor eine reduzierte Transkriptionsaktivität. Aus diesen Untersuchungen schlossen wir, daß die beschriebene Punktmutation eine veränderte Transkriptionsaktivität bedingt und damit zu einem individuell unterschiedlichen Gehalt von SP-B mRNA beitragen könnte.
Surfactant protein B (SP-B), a 8 kDa protein, that is expressed in typ 2 alveolar cells is very essential for surfactant function and therefore lung function. Abnormal surfactant function occurs in humans and genetically engineered mice with SP-B levels below 50% of normal. SP-B mRNA levels vary in fetal lung explants among individuals, possibly due to genetic variety. Polymorphisms within the SP-B gene have been described extensively. Polymorphisms within the 5'-flanking region have been not described so far. We characterized a single nucleotide polymorphism (SNP) found in the upstream enhancer of SP-B, consisting of a single base pair change in the consensus sequence of the most downstream-located thyroid transcription factor 1 binding element in the upstream enhancer of the SP-B 5'-flanking region and located at position 384 upstream of the transcriptional start site of the SP-B gene. In a small patient population (n = 53) we found 70% were homozygous for the wild type (WT), one individual (2%) was homozygous for the polymorphism (Pm), and 28% were heterozygous. To further elucidate possible functions we performed electromobility shift assays with extracts from H441 cells that showed a reduced binding affinity of the mutated sequence compared with WT. In reporter gene assays the Pm caused a reduction of 53% in transcriptional activity compared with WT in transfected H441 cells. Stimulation of these constructs with retinoic acid resulted in enhanced reporter gene activity of both constructs. After stimulation the Pm still exhibited a reduced activity compared with the WT sequence. We conclude that the described SNP causes differences in SP-B transcriptional activity and thus may contribute to individually different SP-B mRNA levels.
