Corneal transparency maintenance is essential for normal vision. In dry eye disease (DED), which afflicts increasing number of individuals, patients experience discomfort due to ocular surface pain and inflammation. Hyperosmolarity of the tear film is one crucial pathogenic factor in the development of ocular surface inflammation in DES. Osmoprotective agents or modulation of putative osmosensitive receptors may help to prevent a hyperosmolar tear film from damaging the ocular surface. Promising receptor targets whose selective modulation may reduce inflammation and pain are transient receptor potential channels (TRPs) such as TRP vanilloid 1 (TRPV1; capsaicin receptor) and TRP melastatin 8 (TRPM8; menthol receptor). TRPs are non-selective cation channels and play a substantial role in Ca2+ regulation. This PhD thesis was undertaken to investigate functional TRPM8 and TRPV1 expression in human conjunctival epithelial cells (HCjEC) and ocular tumor cells such as uveal melanoma (UM). The specific aims are: 1) characterization of the osmoprotective agents through compatible solutes such as L-carnitine on Ca2+ regulation in HCjEC since previous data indicated a link to TRPs. 2) Similar investigations should be carried out using the thyroxine metabolites, so-called thyronamine (3-T1AM). As a result, gene/protein and functional expression of TRPV1/TRPM8 could be detected in HCjEC and uveal melanoma cells. The functional expression of TRPM8 and TRPV1 was demonstrated by using the super cooling agent icilin (20 µM) and specific agonist capsaicin (CAP) (20 µM), respectively. During exposure to L-carnitine (1 mM), TRPV1 activation by hyperosmotic challenge (450 mOsM) or CAP suppressed Ca2+ influx and whole-cell currents in HCjEC. Furthermore, TRPV1 mediated shrinkage induced by exposure to a hyperosmotic challenge was blocked during L-carnitine exposure. In another set of experiments, extracellular application of 3-T1AM (1 µM) led to an increase of intracellular Ca2+ in HCjEC which could be blocked by TRPM8 antagonist indicating TRPM8 activation by 3-T1AM. Interestingly, the increases in TRPV1 functional activity induced by CAP were markedly blunted by pre- stimulating TRPM8 with 3-T1AM. Furthermore, an endpoint of such signaling activation induced by CAP, namely, an approximate 2-fold increase in interleukin-6 (IL-6) release was clearly attenuated during exposure to 3-T1AM. Therefore, inhibition of TRPV1 activity by possible endogenous modulators such as 3-T1AM may suppress inflammation in DES as well as in UM. Taken together, TRPM8, TRPV1 as well as 3-T1AM are interesting targets for the development of (adjuvant) therapies for DED and tumor diseases since (neoplastic) properties of (tumor) cells are determined by Ca2+-dependent cellular mechanisms, which are regulated by TRPs.
Die Erhaltung der Hornhauttransparenz ist essenziell für den Sehvorgang. Beim „Trockenen Auge“, mit wachsender Prävalenz, haben die Patienten Beschwerden, die auf Schmerzen und Entzündung am Auge zurückzuführen sind. Angesichts limitierter Therapieoptionen, die in der Regel nicht die Ursachen beheben, sind besondere Maßnahmen erforderlich um Rezeptoren zu identifizieren, welche die Symptome hervorrufen. Vielversprechende Rezeptoren sind transient Rezeptor Potenzial Kanäle wie beispielsweise TRP Vanilloid 1 Rezeptor (TRPV1; Capsaicinrezeptor) und TRP Melastatin 8 Rezeptor (TRPM8; Mentholrezeptor), dessen Modulation Entzündung und Schmerz reduzieren können. TRP-Kanäle sind nicht-selektive Kationenkanäle und spielen eine substantielle Rolle bei der Calciumregulation. In dieser Doktorarbeit soll die funktionelle Expression von TRPM8 und TRPV1 sowohl in humanen Konjunktiva Epithelzellen (HCjEC) als auch in Augentumorzellen wie uvealen Melanomzellen untersucht werden. Die speziellen Ziele dieses Projekts sind: 1) Charakterisierung des Effekts von Osmoprotektiva mit kompatiblen Soluten wie L-Carnitin auf die Calciumregulation in HCjEC da Voruntersuchungen eine Verbindung zu den TRP- Kanälen hinweisen. 2) Ähnliche Untersuchungen sollen unter Verwendungvon Schilddrüsenhormonmetaboliten wie den sogenannten Thryronaminen (T1AM) durchgeführt werden. Daraufhin konnte die Gen-, Protein- und funktionelle Expression von TRPV1 und TRPM8 in HCjEC und uvealen Melanomzellen nachgewiesen werden. Die funktionelle TRPM8 Expression konnte speziell mit dem pharmakologisch künstlich kühlenden Icilin (20 µM) und dem TRPM8-Blocker BCTC (10 µM) gezeigt werden. Bezüglich des Nachweises der funktionellen TRPV1 Expression wurde Capsaicin (CAP; 20 µM) verwendet. Die Vorbehandlung der Zellen mit L-Carnitin (1 mM) unterdrückte die über hypertonen Stress (450 mOsM) oder über CAP (20 µM) ausgelöste TRPV1 Aktivität. Außerdem blockte die Behandlung mit L-Carnitin die TRPV1-vemittelte Senkung des relativen Zellvolumens nach hyperosmolaren Stress. In einer weiteren Versuchsserie führte die extrazellulare Applikation von 1 µM T1AM zu einer Erhöhung des intrazellulären Calciums in HCjEC, die durch BCTC geblockt werden konnte. Dies weist auf eine TRPM8 Aktivierung über T1AM hin. Interessanterweise konnten die durch CAP aktivierten TRPV1-Kanäle über eine Vorbehandlung der Zellen über T1AM-induzierte TRPM8 Aktivierung unterdrückt werden. Außerdem konnte die TRPV1-induzierte Interleukin-6 (IL-6) Freisetzung durch T1AM deutllich abgeschwächt werden. Die Unterdrückung der TRPV1 Aktivität über mögliche endogene Modulatoren wie T1AM könnten Entzündungsprozesse beim Trockenen Auge unterdrücken als auch das Wachstum von Tumorzellen wie den UM-Zellen inhibieren. TRPM8, TRPV1 sowie 3-T1AM sind interessante Targets für die Entwicklung von (begleitenden) Therapien des Trockenen Auges und auch Tumorerkrankungen da zell- und tumorbiologische Eigenschaften durch Kalzium- abhängige Regulationsmechanismen geprägt sind, die von TRP-Kanäle reguliert werden.
