In the present study, the involvement of the protein kinase C pathway in the regulation of the occludin phosphorylation and tight junction assembly has been investigated. Phorbol 12-myristate 13-acetate and 1,2-dioctanoylglycerol induced the rapid phosphorylation of occludin in MDCK cells cultured in low extracellular calcium medium with a concomitant translocation of occludin to the regions of cell-cell contact. The extent of occludin phosphorylation, as well as the incorporation of occludin and ZO-1 into tight junctions, induced by protein kinase C activators or calcium switch was markedly decreased by the classical and novel protein kinase C inhibitor GF-109203X. Similarly, rottlerin, the inhibitor of novel delta and theta protein kinase C isotypes, blocked both the phosphorylation of occludin and tight junction formation induced by the switch to normal calcium medium. In addition, in vitro experiments showed that recombinant COOH-terminal domain of murine occludin could be directly phosphorylated by purified PKC delta. The application of classical PKC inhibitor Go6976 during calcium switch unexpectedly accelerated the phosphorylation of tight junction protein occludin. The phosphorylation was accompanied by the accelerated incorporation of occludin into newly forming tight junction. Furthermore, Go6976 caused the assembly of tight junctional complex and occludin phosphorylation in cells cultivated in low calcium medium and strongly attenuated the disruption of tight junction complex induced by switch to low calcium medium. A simple procedure for the isolation of highly-phosphorylated occludin forms from rat liver was developed for subsequent identification of phosphorylation sites. Ser371 of rat occludin was identified as an in vivo occludin phosphorylation site by electrospray ionization tandem mass-spectroscopy. Conclusions: TJ assembly is regulated by antagonistic signalling of novel and classical PKC isozymes: the formation of TJ complex is favoured by simultaneous activation of novel PKCs (presumably PKC delta) and inhibition of classical PKC/PKC mu signalling. Occludin was shown to be a target for PKC-mediated signalling: activation of novel PKCs induces the rapid phosphorylation of occludin with a concomitant translocation to the regions of cell-cell contact. Both occludin phosphorylation and incorporation into the newly forming tight junctions was counteracted by the classical PKC signalling. Ser371 was for the first time identified as an in vivo phosphorylation site of Rattus norvegicus liver occludin.
In dieser Arbeit wurde die Beteiligung der Proteinkinase C-Signaltransduktion auf die Regulierung der Occludin Phosphorylierung und der TJ Ausbildung untersucht. Phorbol-12-myristat-13-acetat und 1,2-Dioctanoylglycerin induzierten in MDCK-Zellen, die im Medium mit geringem extrazellulaeren Kalziumgehalt kultiviert wurden, eine schnelle Phosphorylierung von Occludin. Gleichzeitig erfolgte eine Translokalisierung von Occludin in die Regionen der Zell-Zell-Kontakte. Sowohl der Umfang der Occludinphosphorylierung als auch die Inkorporation von Occludin und ZO-1 in die TJ, die durch Proteinkinase C-Aktivatoren oder durch das Kalzium-Switch Modell erreicht wurden, verringerten sich durch den klassischen und neuen Proteinkinase C-Inhibitor GF-109203X signifikant. In gleicher Weise blockte Rottlerin, ein Inhibitor der neuen Proteinkinase C-Isotypen delta und theta, sowohl die Phosphorylierung von Occludin als auch die TJ-Ausbildung, die normalerweise bei Kultivierung im normalen Medium induziert wird. Zusaetzlich zeigten in vitro-Experimente, dass die COOH-terminale Domaene von Occludin (Maus) direkt durch aufgereinigte PKC delta phosphoryliert wird. Waehrend des Kalziumswitches beschleunigte der klassische PKC-Inhibitor Goe6976 unerwartet die Phosphorylierung von Occludin. Dieser Vorgang ging mit der einer Inkorporation von Occludin in die neugebildeten TJ einher. Außerdem fuehrte die Zugabe von Goe6976 bei einer Kultivierung im Medium mit geringem Kalziumgehalt zur Ausbildung des TJ- Komplexes, einer Phosphorylierung von Occludin und einer Verminderung des Abbaus des TJ-Komplexes. Um die Phosphorylierungsstellen in Occludin zu identifizieren, wurde ein einfaches Verfahren zur Isolierung hochphosphorylierter Occludinformen aus Rattenleber entwickelt. Die in vivo Phosphorylierungsstelle Ser371 wurde mit Hilfe der Kapillar-LC /Elektrosprayionisierung-Tandem-Massenspektroskopie identifiziert. Schlussfolgerung: Die TJ-Bildung wird durch antagonistische Signaltransduktionswege klassischer und neuer PKC-Isoenzyme reguliert. Dabei wird die Entstehung des TJ-Komplex bevorzugt durch die Aktivierung der neuen Proteinkinasen C-Signaltransduktion (vermutlich PKC delta) erreicht und durch die klassische Signaltransduktion von PKC/PKC mu inhibiert. Es konnte gezeigt werden, dass Occludin ein Zielgen der PKC-vermittelten Signaltransduktion ist. Die Aktivierung der neuen PKC induziert eine schnelle Phosphorylierung von Occludin mit einer gleichzeitigen Translokalisierung von Occludin in die Regionen der Zell-Zell-Kontakte. Beidem, sowohl der Occludinphosphorylierung als auch der Inkorporation in die neugebildeten TJ, wirkt die klassische PKC- Signaltransduktion entgegen. Zum ersten Mal wurde in Occludin Ser371 als eine in vivo Phosphorylierungsstelle identifiziert.
