dc.contributor.author
Sokolowski, Fabian
dc.date.accessioned
2018-06-08T01:16:57Z
dc.date.available
2005-08-25T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/13181
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-17379
dc.description
0 Titelblatt, Inhalt, Abbildungs- u. Tabellenverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Das Prionprotein 1
1.2 Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie 12
1.3 Zielsetzung 31
2 Material und Methoden 35
2.1 Proteinsynthese und -reinigung 35
2.2 Darstellung von reinem SHaPrP90 232-Oligomer 43
2.3 FTIR-Spektroskopie 45
2.4 MALDI-TOF-Massenspektrometrie 56
2.5 Lichtstreuung 57
2.6 Elektronenmikroskopie 58
2.7 Rasterkraftmikroskopie 58
2.8 FRET-Spektroskopie 58
2.9 Rekonstituierte planare Membranen 59
2.10 Zellkulturexperimente 64
2.11 NMR-Spektroskopie 64
3 Ergebnisse 67
3.1 Charakterisierung der rekombinanten Prionproteine 67
3.2 Das kritische Oligomer des SHaPrP90 232 72
3.3 Weitere Umfaltungs- und Aggregationsbedingungen 90
3.4 Wechselwirkungen von SHaPrP90 232 mit Membranen 101
4 Diskussion 107
4.1 Überblick 107
4.2 Rekombinantes Prionprotein als Modell für die Faltung des PrPC 108
4.3 Stopped-Flow-FTIR-Spektroskopie 111
4.4 Das kritische Oligomer des SHaPrP90 232 115
4.5 Temperaturinduzierte Denaturierung/Aggregation 130
4.6 Wechselwirkung des SHaPrP90 232 mit Membranen 131
4.7 Ausblick 134
5 Zusammenfassung 139
6 Abstract 143
Literaturverzeichnis 147
Abkürzungen 159
Publikationen 163
Danksagung 165
Lebenslauf 167
dc.description.abstract
Das Prionprotein repräsentiert der Nur-Protein-Hypothese folgend den
alleinigen Erreger der sog. Prionkrankheiten, einer Gruppe von übertragbaren
neurodegenerativen Erkrankungen beim Menschen und bei Tieren. Die
krankheitsauslösende Eigenschaft erhält das Prionprotein durch Umwandlung
seiner apathogenen zellulären Form PrPC in die pathogene Scrapie-Form PrPSc.
Diese Umwandlung geht u. a. mit einer Änderung der vorwiegend durch α-Helices
dominierten Sekundärstruktur in eine überwiegend von β-Faltblättern
beherrschte Struktur (α->β-Umfaltung) sowie einer damit verbundenen
Aggregation des Proteins einher. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden
diese α->β-Umfaltung und diese Aggregation am Modell des rekombinanten
Prionproteins des Hamsters SHaPrP90 232 mit mehreren unabhängigen Methoden
unter verschiedenen Bedingungen untersucht. Der methodische Schwerpunkt lag
dabei auf der zeitaufgelösten Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FTIR-
Spektroskopie). Die monomere α-helikale Isoform des SHaPrP90 232 konnte unter
geeigneten Bedingungen in eine β-Faltblatt-reiche oligomere Isoform überführt
werden. Die während der α->β-Umfaltung abnehmenden α-helikalen Anteile der
Sekundärstruktur spiegelten sich in IR-Differenzbanden bei 1 653 cm 1
(Amid-I-Bereich) und 1 551 cm 1 (Amid-II-Bereich) wider, während die
entstehenden β-Faltblatt-Strukturen Differenzbanden bei 1 691 und 1 621 cm 1
(Amid-I-Bereich) sowie bei 1 529 cm 1 (Amid-II-Bereich) hervorriefen. Die Lage
der Amid-I-β-Faltblatt-Banden ist charakteristisch für intermolekulare und
antiparallele β-Faltblatt-Strukturen mit starken Wasserstoffbrückenbindungen.
Der Verlust an α-helikaler Sekundärstruktur und die Bildung von β-Faltblatt-
Struktur fanden gleichzeitig statt, ohne dass eine ungefaltete intermediäre
Isoform identifiziert werden konnte. Darüber hinaus konnte gezeigt werden,
dass innerhalb der experimentellen Totzeit von 250 ms kein β-Faltblatt
gebildet wurde. Der parallel zur α->β-Umfaltung erfolgte
Aggregationsprozess des SHaPrP90 232 wurde mittels Lichtstreuung zeitaufgelöst
untersucht. Dabei zeigte sich, dass das monomere Protein über ein transient
stabiles Oligomer das sog. kritische Oligomer zu Protofibrillen
aggregierte. Die für die Bildung des kritischen Oligomers benötigte Zeit war
ebenso wie dessen Größe von der Proteinkonzentration abhängig. Es wurde eine
minimale Größe des kritischen Oligomers von 8 Monomereinheiten bestimmt.
Mittels Elektronenmikroskopie und Rasterkraftmikroskopie wurde das kritische
Oligomer morphologisch charakterisiert. Es konnten sowohl kompakte als auch
ringförmige Oligomere mit einem Durchmesser von 10 15 nm identifiziert werden,
deren Höhe rund einem Viertel ihrer lateralen Ausdehnung entsprach. Kritische
Oligomere des SHaPrP90 232 wurden rein dargestellt und durch geeignete
Pufferbedingungen stabilisiert; ihre Stabilität wurde mittels MALDI-TOF-
Massenspektrometrie überprüft. Die Wechselwirkungen zwischen dem SHaPrP90 232
in seiner monomeren und seiner oligomeren Form mit Modellmembranen wurden
mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer-Spektroskopie und Experimenten an
rekonstituierten planaren Membranen vergleichend untersucht. Es wurden
deutliche Interaktionen beider SHaPrP90 232-Isoformen mit Membranen, die aus
dem negativ geladenen Phosphatidylserin aufgebaut waren, beobachtet. Keine
Interaktionen konnten hingegen mit Membranen, die aus dem neutralen
Phosphatidylcholin aufgebaut waren, festgestellt werden. Das kritische
Oligomer zeigte dabei in Abhängigkeit des pH-Werts im Vergleich zum Monomer
ähnlich starke oder schwächere Wechselwirkungen mit den untersuchten
Membranen. Weder das kritische Oligomer noch das monomere SHaPrP90 232 konnten
Poren in den untersuchten Membranen bilden. Negativ geladene Membranen wurden
jedoch durch beide Isoformen des Proteins signifikant destabilisiert. Um die
Bildung der kritischen Oligomere von der Entstehung temperaturinduzierter
Aggregate des SHaPrP90 232 abgrenzen zu können, wurde die thermische
Denaturierung des Proteins FTIR-spektroskopisch untersucht. Die durch
Inkubation oberhalb der Denaturierungstemperatur entstandenen β-Faltblatt-
Strukturen riefen Absorptionsbanden hervor, die von denen der kritischen
Oligomere klar unterschieden werden konnten. So zeigten die bei der
thermischen Denaturierung beobachteten β-Faltblatt-spezifischen
Amid-I-Differenzbanden bei 1 690 und 1 624 cm 1 zwar auch eine antiparallele,
intermolekulare β-Faltblatt-Struktur an, doch waren deren Wasserstoffbrücken
deutlich schwächer als die des β-Faltblatts in den kritischen Oligomeren. Um
hochaufgelöste Informationen zur Struktur der kritischen Oligomere zu
gewinnen, wurde vollständig mit dem Kohlenstoffisotop 13C und dem
Stickstoffisotop 15N markiertes 13C-15N-SHaPrP90 232 hergestellt, zu
Oligomeren umgesetzt und ersten NMR-spektroskopischen Experimenten unterzogen.
In den NMR-Spektren der kritischen Oligomere konnten nach vorläufiger
Auswertung hauptsächlich Signale von Aminosäuren aus dem flexiblen
N-terminalen Bereich des Proteins detektiert werden. Demgegenüber konnten
praktisch keine Signale von Aminosäuren aus strukturell geordneten Abschnitten
beobachtet werden. Durch weitergehende Auswertung der bislang gewonnenen Daten
sollten aber sequenzspezifische Strukturinformationen zugänglich sein, anhand
deren sich in naher Zukunft durch Kombination mit den FTIR-Daten dieser
Arbeit erstmals ein Strukturmodell für die kritischen Oligomere des
Prionproteins entwickeln ließe.
de
dc.description.abstract
According to the protein-only hypothesis, the prion protein represents the
sole infectious agent of so-called prion diseases, which are a group of
transmissible neurodegenerative diseases in both humans and animals. The prion
protein gains its disease-causing function by conversion of its apathogenic
cellular form PrPC into the pathogenic scrapie form PrPSc. This conversion
causes a change of the predominantly α-helical secondary structure into a
structure dominated by β-sheets (α->β refolding) and thereby leads to an
aggregation of the protein. Within the scope of the work at hand, this α->β
refolding and aggregation were studied using several independent methods under
a variety of conditions with recombinant Syrian hamster prion protein
(SHaPrP90 232) as a model. Methodical emphasize was placed on time-resolved
Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR spectroscopy). Under appropriate
conditions, the monomeric α-helical isoform of SHaPrP90 232 was transformed
into a β-sheet rich oligomeric isoform. The loss of α-helical parts of the
secondary structure during α->β refolding was represented by IR difference
bands at 1 653 cm 1 (amide I region) and 1 551 cm 1 (amide II region), whereas
the formation of β-sheets was indicated by difference bands at 1 691 and 1 621
cm 1 (amide I region) and at 1 529 cm 1 (amide II region). The position of the
amide I β-sheet difference band is characteristic for intermolecular and
antiparallel β-sheet structures with strong hydrogen bonds. The loss of
α-helical secondary structure and the formation of β-sheets occurred
concomitantly; an unfolded intermediate state has not been observed.
Furthermore, it could be shown that no β-sheet was formed within the
experimental dead time of 250 ms. The aggregation process of SHaPrP90 232,
which paralleled the α->β refolding, was investigated by time-resolved
light scattering. Thereby, it was observed that monomeric protein aggregated
to protofibrils via a transient stable oligomer: the so-called critical
oligomer. Both the time required for formation of the critical oligomer and
its size were dependent on protein concentration. The minimal size of the
critical oligomer was assigned to 8 monomer units. By electron microscopy and
atomic force microscopy the critical oligomer was morphologically
characterised. Both compact and annular shaped oligomers were identified.
Their diameter was 10 15 nm with their height being only a quarter of their
width. Pure critical oligomers of SHaPrP90 232 were produced and stabilised by
appropriate buffer conditions; their stability was checked by MALDI-TOF mass
spectrometry. Interactions between SHaPrP90 232 in its monomeric and in its
oligomeric form with model membranes were comparatively investigated by
fluorescence resonance energy transfer spectroscopy and by experiments with
reconstituted planar membranes. Significant interactions of both isoforms with
membranes constituted of negatively charged phosphatidylserine could be
observed. No interactions, however, were detected with membranes constituted
of neutral phophatidylcholine. Compared to the monomer, the critical oligomer
showed depending on pH equally strong or weaker interactions with the examined
membranes. Neither the critical oligomer nor the monomeric SHaPrP90 232 were
able to form pores within the examined membranes. However, negatively charged
membranes were significantly destabilised by both isoforms of the protein. To
distinguish between formation of critical oligomers and creation of
temperature induced aggregates of SHaPrP90 232, thermal denaturation of the
protein was investigated by FTIR spectroscopy. The β-sheet structures formed
by incubation above the denaturation temperature evoked absorption bands that
could be clearly distinguished from those of the critical oligomers: Although
also the β-sheet specific amide I difference bands at 1 690 and at 1 624 cm 1,
observed during thermal denaturation, were indicative for antiparallel
intermolecular β-sheet structure, the hydrogen bonds of this structure were
clearly weaker than those of the β-sheets of critical oligomers. To gain high
resolution information on the structure of critical oligomers, 13C-15N-
SHaPrP90 232 completely labelled with the carbon isotope 13C and the nitrogen
isotope 15N was produced, transformed into critical oligomers and used for
initial experiments by NMR spectroscopy. After primary evaluation of the data,
mainly signals from the flexible N-terminal region of the protein could be
observed in the NMR spectra of critical oligomers. Contrary, almost no signals
from amino acids lying in structured parts of the protein could be observed.
After further evaluation of the data, more sequence specific structural
information should be available, on the basis of which it should soon be
possible to develop in combination with the FTIR data of this work a
structural model of the critical oligomers of the prion protein.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Biophysikalische Charakterisierung von Oligomeren des rekombinanten
Prionproteins
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Dieter Naumann
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Wolfram Saenger
dc.date.accepted
2005-08-01
dc.date.embargoEnd
2005-08-26
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2005002405
dc.title.translated
Biophysical characterisation of oligomers of recombinant prion protein
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000001692
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2005/240/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000001692
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access