Ribosomes translate the genetic information encoded in the mRNA with an extremely high efficiency and accuracy. In this respect, maintenance of the correct reading frame is one of the major tasks achieved by the ribosomes during the protein synthesis process. A spontaneous change in the reading frame generates truncated and usually non-functional proteins resulting in the loss of the genetic information. Normally a spontaneous frame-shift occurs approximately once in 30,000 incorporations of amino acids. However, in the case of the synthesis of the termination factor a frameshift has to occur, since the 26th codon of the RF2 mRNA is the stop codon UGA. At this stop codon a +1 frameshift is required for the RF2 synthesis, and it occurs with an efficiency of up to 100% if the RF2 concentration is low, that is with a frequency that is four orders of magnitude larger than that normally observed during protein synthesis. The presence of the internal stop codon of the RF2 mRNA is the basis of the translational feed-back regulation of the RF2 synthesis. If the concentration of RF2 is sufficiently high in the cell, RF2 recognizes the stop codon UGA on its own RF2 mRNA at the codon position 26, with the result that an oligopeptide of 25 amino acids is synthesized, released and fast degraded. However, at a low concentration of RF2 a (+1) frameshift occurs that is necessary for a complete synthesis of the RF2 protein. In this work the mechanism of this extreme frameshift event has been elucidated and resolved. Moreover, evidence is provided that an occupation of the E site with a deacylated tRNA is essential for maintaining the reading frame. We demonstrate that the internal Shine Dalgarno (SD) sequence in front of the stop codon UGA (26th codon) of the RF2 mRNA plays a critical role for the mechanisms of the RF2 feed-back regulation. When the internal UGA is at the A site, the SD sequence is separated from the peptidyl-tRNA at the P site by an extremely short spacer sequence of only two nucleotides and thus interferes with the first nucleotide of the E site codon. The result is a steric clash between the SD-antiSD of the 16S rRNA and codon-anticodon interaction, and we show that this clash triggers the release of the E-site tRNA. The resulting ribosome with only one tRNA, the peptidyl-tRNA at the P site, is a situation that never exists during elongation, where statistically always two tRNAs are on the ribosome. The short spacer forces this non- elongating ribosome to move (+1) nucleotide downstream displaying the frameshifted codon GAC for Asp at the A site. We demonstrate that the loss of the tRNA at the E site is correlated with the incorporation of Asp. However, when the SD sequence is shifted by two or six nucleotides upstream from the wild type position, the tRNA at the E-site is not released and a frameshift does not occur. The in vitro translation system developed for the analysis of the frameshift at the RF2 mRNA shows for the first time a frameshift frequency near 100% reflecting the known data in vivo. We further demonstrate that the E-site tRNA is not removed by a normal RF2 "decoding" of the stop codon UGA. Therefore, the tRNA release from the E site has to occur at a later step of a normal termination process, a fact that is neglected by current models of termination. Our data demonstrate further for the first time that a cognate tRNA at the E site is instrumental for maintaining the reading frame, and that the loss of the E site tRNA is the trigger for the enormous efficiency of frameshifting during the translational regulation of the RF2.
Ribosomen übersetzen die genetische Information, die in der mRNA kodiert ist, mit extrem hoher Effizienz und Genauigkeit. In dieser Hinsicht ist die Aufrechterhaltung des korrekten Leserahmens während der Proteinsynthese eine der wesentlichen Aufgaben des Ribosoms. Ein spontaner Wechsel des Leserahmens führt zu unvollständigen und gewöhnlich nicht funktionsfähigen Proteinen und damit zu einem Verlust der genetischen Information. Normalerweise kommt eine spontane Änderung des Leserahmens einmal alle 30.000 eingebauten Aminosäuren vor. Im Fall der RF2 Synthese muss jedoch ein Leserahmenwechsel in +1 Richtung erfolgen, da das 26igste Codon das Stoppcodon UGA ist, das mit dem Leserahmenwechsel bei niedriger RF2 Konzentration umgangen wird und erst durch den Leserahmenwechsel zur vollständigen Synthese von RF2 führt. Der Leserahmenwechsel erfolgt mit einer erstaunlichen Effizienz von bis zu 100%, d.h. mit einer um vier Zehnerpotenzen größeren Häufigkeit als bei der üblichen Proteinsythese. Das interne Stoppcodon der RF2 mRNA ist die Basis der regulatorischen Rückkopplung der RF2 Synthese. Falls die RF2 Konzentration genügend hoch ist, erkennt RF2 das interne Stoppcodon an der 26igsten Codonposition seiner eigenen mRNA, mit dem Ergebnis, dass ein Oligopeptid von 25 Aminosäuren synthetisiert, vom Ribosom entlassen und schnell abgebaut wird. Falls hingegen die RF2 Konzentration niedrig ist, erfolgt der beschriebene +1 Leserahmenwechsel, was die RF2 Synthese ermöglicht. In dieser Arbeit wird der Mechanismus des extrem effizienten Leserahmen-wechsels aufgeklärt. Darüber hinaus wird nachgewiesen, dass die Besetzung der E Stelle eine Voraussetzung für die Erhaltung des Leserahmens während der Proteinsynthese ist. Wir zeigen, dass die interne Shine-Dalgarno (SD) Sequenz vor dem internen Stoppcodon UGA (26igster Codon) der RF2-mRNA von kritischer Bedeutung für den Mechanismus der Regulation der RF2 Synthese ist. Wenn das interne Stoppcodon UGA in der A Stelle angelangt ist, liegt die SD Sequenz nur mit einer extrem kurzen Spacersequenz von 2 Nukleotiden stromaufwärts von der Peptidyl-tRNA in der P Stelle und überlappt damit mit der ersten Codonposition der E-Stellen tRNA. Dieser Sachverhalt führt zu einem sterischen Konflikt zwischen SD-AnitSD der 16S rRNA und Codon-Anticodon-Wechselwirkung in der E Stelle, und dieser sterische Zusammenstoß, wie hier gezeigt wird, führt zur Entlassung der tRNA aus der E Stelle. Damit besitzt das Ribosom nur eine tRNA, nämlich die Peptidyl-tRNA in der P Stelle, eine Situation, die während der Elongation nicht vorkommt, da während der Elongation statistisch immer zwei tRNAs auf dem Ribosom befinden. Wegen des kurzen Spacers drückt die SD-AntiSD Wechselwirkung das Ribosom mit seiner einen tRNA um ein Nukleotid stromabwärts, was das +1 Codon GAC für Asp in die A Stelle einstellt. Wir zeigen, dass der Verlust der tRNA aus der E Stelle mit dem Einbau Asp Aminosäure einhergeht. Wenn jedoch die SD Sequenz um zwei oder sechs Nukleotiden stromaufwärts verschoben wird, bleibt die Entlassung der tRNA aus der E Stelle sowie ein Wechsel des Leserahmens aus (kein Einbau von Asp). Das in vitro Translationssystem, das für die Analyse der RF2-mRNA Translation entwickelt wurde, kann zum ersten mal in vitro einen Leserahmenwechsel von bis zu 100% entsprechend den in vivo Befunden nachweisen. Wir zeigen ferner, dass die E-Stellen tRNA bei einer "normalen" UGA Dekodierung durch RF2 nicht entlassen wird. Deshalb muss die E-Stellen tRNA in einem späteren Schritt der Terminationsphase entlassen werden, was in den vorherrschenden Modellen der Translations-Termination nicht berücksichtigt ist. Unsere Daten demonstrieren weiterhin zum ersten mal, dass eine tRNA in der E Stelle für die Aufrechterhaltung des Leserahmens von fundamentaler Bedeutung ist, und dass ein Verlust der E-Stellen tRNA den enorm effizienten Leserahmenwechsel während der RF2 Synthese auslöst.
