The extended and controlled drug delivery from biodegradable, poly(lactic-co- glycolic acid) (PLGA) based parenteral depot systems represents an attractive way in the long-term treatment of many diseases. In the late 1990s non-aqueous in situ forming microparticle (ISM) systems have been developed as an alternative to implants, microparticles and in situ forming implants (ISI). Non-aqueous ISM systems are injectable emulsions where a drug-containing organic polymer solution (ISI) is emulsified into a stabilizer-containing oily continuous phase. ISM emulsions can be prepared in a two-syringe/connector system prior to administration by back and forth movements of the syringe plungers. Upon injection into the body the polymer solidifies forming microparticles in situ. The encapsulated drug is then released over extended periods of time from days to months. However, non-aqueous ISM emulsions showed a relatively low emulsion stability of only a few minutes. Coalescence of the highly viscous polymer-containing internal phase may complicate the injection through small needles and may result in the formation of implant-like polymer matrices instead of microparticles which could change the release pattern of incorporated drugs. In order to improve the stability of non-aqueous ISM emulsions and due to a lack of general knowledge about the stabilization of non-aqueous emulsions, a variety of parenteral approved excipients were screened for a stability-enhancing effect. Ethanolamine, the phospholipid Lipoid® S 100 and glycerol monostearate (GMS) were found to stabilize non- aqueous ISM emulsions for more than 15 minutes which is an appropriate time frame to administer the ISM emulsion to the patient. Interestingly, GMS stabilized emulsions showed superior stability over more than 12 hours. The objective of this work was therefore to investigate the stabilizing potential of GMS in more detail. Hence, the underlying stabilization mechanisms were identified, the effect of emulsion stabilization on the injectability of the resulting ISM formulation evaluated, the stabilizing capacity of GMS with regard to changes in formulation and process parameters characterized and finally the influences of GMS stabilized ISM formulations on the release of different drugs elucidated. Flow behaviour analysis, differential scanning calorimetry, hot-stage polarized light-and cryo electron microscopy revealed that the ISM emulsions were stabilized trough the formation of a liquid crystalline GMS layer surrounding the polymer solution droplets and a more than 5-fold viscosity increase in the continuous phase immediately after emulsification due to the formation of a viscous, shear thinning GMS gel network. GMS stabilized ISM emulsions could be easily and smoothly injected through hypodermic needles, while high injection peak forces were observed from unstable ISM emulsions due to coalescence of the highly viscous PLGA solution droplets. Moreover, ISM emulsions stabilized with GMS showed an improved injectability of about 30 % in comparison to the corresponding ISI solutions. The injectability improvement allows a faster administration or enables the use of thinner needles and hence reduced patient discomfort. Stable ISM emulsions could be formed with at least 5 % GMS (based on continuous phase) under various changes in formulation and process parameters such as with a PLGA 502 S content up to 40 %, a continuous phase:internal phase ratio of at least one, various oil types and in a temperature range from 15 to 33 °C. Low and high molecular weight drugs could be incorporated without a visible destabilizing effect. However, GMS stabilized ISM emulsions were sensitive to changes in the internal phase as the organic solvent and the polymer type. This was explained with an increased internal phase viscosity decreasing droplet break-up during emulsification and/or changes in the polarity impeding the formation of the droplet interface stabilizing liquid crystals. The preparation time of GMS containing ISM formulations in the two- syringe/connector system could be reduced from 180 s to less than 30 s by increasing the shear force during emulsification using smaller connector diameters (0.75 mm) and a fast mixing speed (2 cycles / s). This simplified the handling of the system which can be prepared prior to administration by the patient himself. While evaluating the ISM stabilization mechanisms, pronounced polymorphism of GMS in the continuous oil phase was identified. This may also have an effect on the ISM emulsion stability. Therefore, the polymorphic characteristics of GMS were further investigated. Three GMS modifications (α, β’ and β) were identified in the continuous oily phase. The formation of the stabilizing GMS gel network in the oil phase could be attributed to the fine amorphous-like α-modification. β’ and β crystals grew up to approximately 100 µm in size throughout continuous phase storage, but were completely transformed into liquid crystals during ISM emulsion preparation. Hence, variations in the polymorphic composition of GMS did not affect its ability to stabilize ISM emulsions. The drug release characteristics from GMS stabilized non-aqueous ISM formulations were investigated with low molecular weight model drugs (theophylline, diprophylline and carbamazepine) and the high molecular weight model protein lysozyme. Low molecular weight drug release was dependent on drug properties like the solubility in the organic solvent of the internal phase as well as on formulation properties such as the size and shape of the in situ formed polymer matrix. Droplets from less stable ISM emulsions coalesced prior to polymer precipitation forming implant-like matrices, while microparticles were formed with at least 5 % GMS in the continuous phase. Microparticles showed a faster drug release in comparison to the implant-like matrices which could be related to the overall increased surface area. Polarized light microscopy and cryo-scanning electron microscopy revealed that the ISM emulsion stability did not only influence the external morphology of in situ formed polymer depots but also affected their porosity. The in situ formed microparticles exhibited a nano-porous structure in comparison to a micro-porous structure observed in implant-like matrices. This significantly changed the release pattern of the model protein lysozyme. The underlying main release mechanism was shifted from diffusion through the porous network within the implant-like depots to a more extended erosion controlled release from microparticles after approximately 5 weeks. In addition, the impact of the continuous phase oil type (MCT, castor and sesame oil) surrounding the polymer depots on PLGA degradation and on lysozyme release was investigated. Surprisingly, gel permeation chromatography showed no effect of the continuous phase on the PLGA degradation rate. However, the higher viscous castor oil was able to prevent an initial burst release of lysozyme. Furthermore, also the lysozyme activity was not influenced by the continuous phase composition. It was found that the activity was sensitive to the increased polymer erosion rate after approximately 5 weeks. Thus, active lysozyme may be completely released via diffusion within 1 month from ISM formulations forming high porous polymer matrices. Finally, a long-term stability study revealed that continuous phases could be stored at 4 °C for more than 1 year without compromising the ISM emulsion stability and the release pattern of the model protein lysozyme. In conclusion, glycerol monostearate showed high potential as a stabilizer for non-aqueous ISM emulsion systems feasible in a broad range of formulation and process parameters. Stable ISM emulsions showed improved injectability in comparison to the corresponding ISI systems. The drug release pattern was affected by alterations in the stability of the ISM emulsion due to the formation of differently shaped and dense polymer depots.
Die verlängerte und kontrollierte Arzneistofffreisetzung aus bioabbaubaren, auf Polylactidglykolid (PLGA) basierenden, parenteral applizierbaren Depotsystemen stellt eine attraktive Möglichkeit der Langzeitbehandlung vieler Erkrankungen dar. Als Alternative zu bekannten Depotsystemen, wie Implantaten, Mikropartikeln und in situ bildenden Implantaten (ISI) wurde gegen Ende der 1990er Jahre ein System entwickelt, das auf der Bildung von in situ Mikropartikeln (ISM) aus wasserfreien Emulsionen beruht. Diese Emulsionen bestehen aus einer organischen PLGA Lösung, die in eine Stabilisator enthaltende äußere Ölphase emulgiert ist. Mit Hilfe eines 2-Spritzensystems können ISM-Emulsionen direkt vor der Anwendung hergestellt werden. Dabei werden die zwei Phasen durch hin- und herbewegen der zwei Spritzenkolben miteinander vermischt. Nach erfolgter subkutaner oder intramuskulärer Injektion präzipitiert das Polymer in der Form von Mikropartikeln. Darin eingeschlossener Arzneistoff kann dann über Tage bis hin zu Monaten kontinuierlich freigesetzt werden. Trotz mehrerer Vorteile gegenüber den anderen Depotsystemen könnte die relativ niedrige Emulsionsstabilität der bisherigen wasserfreien ISM-Systeme von nur ein paar Minuten problematisch sein. Ein Zusammenfließen der hochviskosen Polymer enthaltenden Emulsionströpfchen würde die Injektion durch dünne patientenfreundliche Subkutannadeln erschweren oder sogar unmöglich machen. Des Weiteren würden sich eher implantatartige Polymerdepots anstatt Mikropartikel in situ bilden, was demzufolge auch das Arzneistofffreisetzungsverhalten beeinflussen würde. Daher wurde in einem ersten Experiment versucht, die Stabilität der wasserfreien ISM-Emulsionen zu erhöhen. Aufgrund eines generellen Mangels an grundlegendem Wissen über die Stabilisierung von nichtwässrigen Emulsionssystemen wurde eine größere Anzahl von parenteral zugelassenen Hilfsstoffen auf einen emulsionsstabilisierenden Effekt hin untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass Ethanolamin, das Phospholipid Lipoid® S100 und Glycerolmonstearat (GMS) wasserfreie ISM-Emulsionen für mehr als 15 Minuten gegen Tröpfchenkoaleszenz stabilisieren konnten. Ein Zeitraum von 15 Minuten wurde gewählt, da dieser ausreichen sollte, um die Formulierung Patienten zu injizieren. Interessanterweise zeigten GMS enthaltende Emulsionen eine herausragende Stabilität von mehr als 12 Stunden. Die Zielsetzung dieser Arbeit war es daher, das Potenzial von GMS detaillierter zu untersuchen. Dafür wurden als erstes die stabilisierenden Mechanismen von GMS in wasserfreien ISM-Emulsionen aufgeklärt und anschließend der Einfluss der Emulsionsstabilisierung auf die Injektionsfähigkeit der ISM-Formulierungen evaluiert. Des Weiteren wurde die Stabilisierungskapazität von GMS im Hinblick auf Veränderungen von Formulierungs- und Prozessparametern charakterisiert und schließlich das Freisetzungs-verhalten von verschiedenen Arzneistoffen aus wasserfreien GMS-stabilisierten ISM-Formulierungen untersucht. Durch eine Analyse des Fließverhaltens, Dynamische-Differenz-Kalorimetrie, Heiztischpolarisations- und Kryorasterelektronenmikroskopie wurde herausgefunden, dass die wasserfreien ISM-Emulsionen zum einen durch flüssigkristalline GMS-Filme stabilisiert wurden, welche sich während des Emulgierungsvorganges um die Polymerlösungströpfchen geformt hatten. Zum anderen wurden die Emulsionen durch eine mehr als fünffache Viskositätserhöhung der äußeren Phase nach dem Emulgierungsvorgang stabilisiert. Dies konnte auf die Bildung eines scher-verdünnenden GMS- Gelnetzwerkes in der äußeren Phase zurückgeführt werden. GMS-stabilisierte ISM-Emulsionen konnten leicht und gleichmäßig durch Subkutannadeln injiziert werden. Nicht stabilisierte ISM-Formulierungen hingegen zeigten hohe Injektionskraftspitzen aufgrund von Koaleszenz der hochviskosen Polymerlösungströpfchen. Darüber hinaus zeigten stabilisierte ISM-Emulsionen eine um etwa 30 % verbesserte Injektionsfähigkeit gegenüber den entsprechenden ISI-Systemen (einfache Polymerlösung). Die verbesserte Injektionsfähigkeit erlaubt entweder eine schnellere Injektion oder die Benutzung von dünneren Nadeln. Beide Möglichkeiten würden zu einer Verbesserung der Patientenfreundlichkeit führen. Ein Gehalt von mindestens 5 % GMS in der äußeren Phase (m/m) war nötig, um stabile ISM-Emulsionen in einem großen Bereich von Formulierungs- und Prozessparametern herstellen zu können, wie zum Beispiel mit PLGA 502S Konzentrationen bis 40 %, mit einem Verhältnis der Äußeren zur Inneren Phase von mindestens eins, mit verschiedenen Ölsorten, sowie in einem Temperaturbereich von 15 bis 33 °C. Verschiedene nieder- und hochmolekulare Arzneistoffe konnten ohne einen sichtbaren emulsionsdestabilisierenden Einfluss in die ISM-Formulierungen eingebracht werden. Jedoch zeigten GMS-stabilisierte ISM-Emulsionen eine Sensibilität gegen Veränderungen in der Inneren Phase (organisches Lösungsmittel, Polymer). Dies konnte mit einer erschwerenden Tröpfchenzerkleinerung mit ansteigender Viskosität der inneren Phase und/oder einer Verhinderung der Bildung von flüssigkristallinen Strukturen von GMS an der Tropfengrenzfläche erklärt werden. Durch eine Erhöhung der Scherkräfte während des Emulgiervorganges im 2-Spritzensystem konnte mit der Benutzung von dünneren Konnektoren mit einem Durchmesser von 0,75 mm und einer hohen Mischgeschwindigkeit von zwei Mischzyklen pro Sekunde die Herstellungszeit von GMS-stabilisierten ISM- Emulsionen von 180 zu weniger als 30 Sekunden reduziert werden. Dadurch wurde die Handhabung des Systems vereinfacht, das direkt vor der Applikation vom Patienten selbst hergestellt werden kann. Während der Ermittlung der Stabilisierungsmechanismen wurde ein ausgeprägter Polymorphismus von GMS in der äußeren Phase festgestellt. Da dies unter anderem auch die Emulsionsstabilität beeinflussen könnte, wurden die Charakteristika der GMS- Modifikationen eingehender erforscht. Drei GMS-Modifikationen (α, β’ and β) konnten in der äußeren Ölphase nachgewiesen werden. Die Bildung des stabilisierenden GMS-Gelnetzwerkes konnte auf die feine amorph-ähnliche α-Modifikation zurückgeführt werden. Während der Lagerung der äußeren Phase wuchsen β’- und β-Kristalle bis zu einer Größe von etwa 100 µm. Interessanterweise beeinträchtigte dies nicht die Fähigkeit, ISM-Emulsionen zu stabilisieren. Während der Emulgierung transformierten die Kristalle vollständig zu flüssigkristallinen Strukturen in der Phasengrenzfläche. Das Freisetzungsverhalten von Arzneistoffen aus GMS-stabilisierten wasserfreien ISM-Formulierungen wurde an niedermolekularen Modellarzneistoffen (Theophyllin, Diprophyllin und Carbamazepin) und dem hochmolekularen Modellprotein Lysozym untersucht. Die Freisetzung von niedermolekularen Substanzen war abhängig von Arzneistoffeigenschaften, wie deren Löslichkeit im organischen Lösungsmittel der inneren Phase, und von Formulierungsparametern, wie die Größe und Form der in situ gebildeten Polymerdepots. Große implantatähnliche Depots wurden aufgrund des Zusammenfließens von Emulsionströpfchen vor der Polymerpräzipitation von zu gering stabilisierten ISM-Emulsionen geformt. Mikropartikel konnten von ISM-Formulierungen geformt werden, die mit mindestens 5 % GMS (basierend auf der äußeren Phase) stabilisiert waren. Niedermolekulare Arzneistoffe wurden im Vergleich zu den implantatähnlichen Depots von Mikropartikeln schneller freigesetzt, was mit der höheren Oberfläche von Mikropartikeln begründet werden könnte. Mit Hilfe der Polarisations- und Kryorasterelektronenmikroskopie wurde herausgefunden, dass die Emulsionsstabilität nicht nur die äußere Morphologie der in situ geformten Polymerdepots beeinflusste, sondern auch das Ausmaß der Porosität. In situ geformte Mikropartikel zeigten nano-poröse Strukturen. Eher mikro- poröse Strukturen wurden in den implantatähnlichen Gebilden gefunden. Dies veränderte signifikant das Freisetzungsverhalten vom Modellprotein Lysozym. Der zugrundeliegende Hauptfreisetzungsmechanismus verlagerte sich von Diffusion durch Poren aus den implantatähnlichen Depots zu einer verlängerten, erosionskontrollierten Freisetzung aus den nano-porösen Mikropartikeln. Diese setzte etwa nach 5 Wochen ein. Anschließend wurde der Einfluss der Öl-Sorte der äußeren Phase (MCT, Sesamöl und Rizinusöl) auf den PLGA-Abbau und die Lysozym-Freisetzung untersucht. Mit Gelpermeationschromatographie konnte gezeigt werden, dass der Abbau des Polymers nicht von der äußeren Phase beeinflusst wurde. Somit konnte ein verändertes Freisetzungsverhalten erneut auf die Bildung von unterschiedlich porösen Polymerdepots zurückgeführt werden. Interessanterweise zeigte sich jedoch, dass durch die Nutzung von hochviskosem Rizinusöl ein initialer Burst komplett vermieden werden konnte. In einem weiteren Experiment konnte gezeigt werden, dass die Zusammensetzung der äußeren Phase auch nicht die Aktivität von Lysozym beeinflusste. Diese reagierte jedoch empfindlich auf eine nach etwa 5 Wochen ansteigende Polymererosionsrate. Daher könnten ISM-Formulierungen, die die Lysozymbeladung innerhalb eines Monats durch Diffusionsprozesse freigeben, genutzt werden, um ausschließlich aktives Lysozym freizusetzen. Eine abschließende Langzeitstabilitätsstudie zeigte, dass die äußere Phase für mehr als ein Jahr bei 4 °C gelagert werden kann, ohne einen Einfluss auf die ISM- Emulsionsstabilität und das Freisetzungsverhalten von Lysozym aufzuweisen. Fazit: Glycerolmonostearat zeigte ein hohes Potenzial, wasserfreie ISM- Emulsionen in einem breiten Bereich variierender Formulierungs- und Prozessparameter zu stabilisieren. Stabile ISM-Emulsionen wiesen eine verbesserte Injizierbarkeit im Vergleich zu ISI-Systemen auf. Das Arzneistofffreisetzungsverhalten von ISM-Systemen wird unter anderem von Veränderungen in der Emulsionsstabilität - aufgrund der Bildung von verschieden geformten Polymerdepots unterschiedlicher Dichte - beeinflusst.
