Molekulare Determinanten und Spezifität der Gbetagamma-Regulation von Klasse I Phosphatidylinositol-3-Kinasen

Abstract

Klasse I PI-3-Kinasen sind wichtige ýsecond messengerý-bildende Enzyme, die an einer Vielzahl von zellulären Prozessen wie Zellwachstums- und Differenzierungsvorgängen, cytoskelettalen Veränderungen oder der Steuerung von vesikulären Transportvorgängen beteiligt sind. Um die G-Protein- Sensitivität dieser Enzymklasse besser zu verstehen, wurden die vier heterodimeren Klasse I PI-3-Kinasen auf ihre Sensitivität gegenüber Gbg untersucht. Dabei konnten die PI-3-Kinase b und -g sowohl in An- als auch in Abwesenheit ihrer jeweiligen nicht-katalytischen Untereinheit, p85 bzw. p101, durch nanomolare Konzentration von Gbg stimuliert werden. Folglich stimmt die strukturelle Einteilung der Klasse I PI-3-Kinasen in p85- und nicht p85-assoziierte Formen nicht, wie bisher angenommen, mit der Sensitivität gegenüber Rezeptor-Tyrosin-Kinasen und Gbg überein.

Um die Rolle der p101-Untereinheit bei der Gbg-vermittelten Aktivierung genauer zu analysieren, wurden Gbg-Stimulationsversuche mit der monomeren (p110g) und der heterodimeren (p101/p110g) PI-3-Kinase g in Anwesenheit verschiedener Lipidsubstrate durchgeführt. Dabei zeigte sich, daß die p101-Untereinheit die Substratselektivität der Gbg-stimulierten PI-3-Kinase g beeinflußt. Einerseits wurde durch die p101 die Gbg-Stimulation der PI- Phosphorylierung gehemmt, andererseits wurde die Sensitivität der p110g für Gbg in Anwesenheit von PI-4,5-P2 stark erhöht. Dieser Mechanismus könnte teilweise eine Erklärung dafür sein, daß es nach Stimulation Gbg-sensitiver PI-3-Kinasen in vivo zur selektiven Phosphorylierung von PI-4,5-P2 und damit zur Bildung von PI-3,4,5-P3 kommt, obwohl auch PI und PI-4-P in vitro- Substrate für Klasse I PI-3-Kinasen sind.

Um die Spezifität der Interaktion von Gbg mit PI-3-Kinasen zu analysieren, wurden verschiedene Gbg-Isoformen auf ihre Fähigkeit zur Stimulation der PI-3-Kinase b und -g untersucht. Während Gb1g2, Gb2g2 und Gb3g2 mit fast identischer Potenz und Effizienz die PI-3-Kinase g stimulierten, zeigte Gb5g2 keine stimulatorische Aktivität an den getesteten PI-3-Kinase-Isoformen. Dies umfaßte sowohl die Lipid- und Proteinkinase-Aktivität der PI-3-Kinase g als auch die Lipidkinase-Aktivität der PI-3-Kinase b, mit und ohne Kostimulation durch ein Tyr-phosphoryliertes p85-Bindungspeptid. Der Grund für die fehlende Stimulierbarkeit durch Gb5g2 war die fehlende Interaktionsfähigkeit zwischen Gb5g2 und der PI-3-Kinase b bzw -g. Hieraus kann geschlossen werden, daß Klasse I PI-3-Kinasen nicht durch Gb5 reguliert werden.

Die vorgestellten Untersuchungen zeigen, daß die Spezifität G-Protein- abhängiger PI-3-Kinase-Signale auf verschiedenen Ebenen determiniert ist. Auf Rezeptorebene, indem nur bestimmte PI-3-Kinase-Isoformen aktiviert werden, auf G-Protein-Ebene, da PI-3-Kinasen nur von bestimmten Gbg-Untereinheiten stimuliert werden können, und auf der PI-3-Kinase-Ebene selbst, wo die selektive Bildung von 3´-phosphorylierten Lipidprodukten die Vielfalt der auslösbaren Effekte einschränkt.

Class I PI-3-kinases are important second messenger-generating enzymes and play a role in a variety of cellular processes such as mitogenesis, cytoskeletal rearrangement or vesicular trafficking. To better understand the G protein sensitivity of these enzymes, all four heterodimeric class I PI-3-kinases were examined for their sensitivity towards Gbg. The PI-3-kinases b and -g were stimulated by nanomolar concentrations of Gbg in the presence as well as in the absence of their non-catalytic subunits, p85 and p101, respectively. Therefore the classification of class I PI-3-kinases into p85- und not p85-associated forms does not correlate with their sensitivity towards receptor tyrosine kinases and Gbg.

To examine the role of p101 in Gbg-mediated activation in more detail, monomeric (p110g) and heterodimeric (p101/p110g) PI-3-kinase g were stimulated with Gbg in the presence of different lipid substrates. The experiments revealed that p101 affects the substrate preference of Gbg-stimulated PI-3-kinase g. On the one hand, p101 inhibits Gbg-stimulation of PI- phosphorylation, on the other hand it strongly increases the sensitivity of p110g to Gbg in the presence of PI-4,5-P2. This mechanism may be an explanation for the observation that Gbg-stimulation of PI-3-kinases ýin vivoý leads to a selective phosphorylation of PI-4,5-P2 and thereby to the production of PI-4,5-P3, although PI und PI-4-P are in vitro-substrates for class I PI-3-kinases.

To analyze the specificity of interaction between Gbg and PI-3-kinases, distinct Gbg-isoforms were examined for their ability to stimulate the PI-3-kinases b and -g. Whereas Gb1g2, Gb2g2 and Gb3g2 stimulated PI-3-kinase g with similar potencies and efficacies, Gb5g2 showed no stimulatory activity on both PI-3-kinase isoforms. This behaviour comprised the lipid- and protein kinase activity of PI-3-kinase g as well as the lipid kinase activity of PI-3-kinase b, with or without costimulation by a Tyr-phosphorylated p85-binding peptide. The inability of Gb5g2 to stimulate PI-3-kinase b or -g was caused by lack of interaction. Thus, class I PI-3-kinases are not regulated by Gb5.

The presented data show that specificity of G protein-dependent PI-3-kinase signaling is determined on different levels. On the level of receptors, because only a subset of class I PI-3-kinases are activated, on the level of G proteins, since only distinct Gbg-isoforms are able to stimulate PI-3-kinases, and on the level of PI-3-kinases, because the selective formation of 3´-phosphorylated lipid products restricts the variety of conceivable signals.