id,collection,dc.contributor.author,dc.contributor.firstReferee,dc.contributor.furtherReferee,dc.contributor.gender,dc.date.accepted,dc.date.accessioned,dc.date.available,dc.date.embargoEnd,dc.date.issued,dc.description,dc.description.abstract[de],dc.description.abstract[en],dc.identifier.uri,dc.identifier.urn,dc.language,dc.rights.uri,dc.subject,dc.subject.ddc,dc.title,dc.title.translated[en],dc.type,dcterms.accessRights.dnb,dcterms.accessRights.openaire,dcterms.format[de],refubium.affiliation[de],refubium.mycore.derivateId,refubium.mycore.fudocsId,refubium.mycore.transfer "0c75ee71-3f39-4d7c-a4f9-7da708d88cf8","fub188/14","Maier, Udo","Prof. Dr. Dr. Bernd Nürnberg","Prof. Dr. Dr. Dr. h.c. Walter Schunack","n","2000-05-26","2018-06-07T15:34:47Z","2000-06-26T00:00:00.649Z","2000-08-24","2000","### ### TITEL ### ### INHALTSVERZEICHNIS ### ### BEGRIFFE, ABKÜRZUNGEN ### 1 ### EINLEITUNG 1.1 Allgemeine Prinzipien der zellulären Kommunikation 1.2 G-Protein-abhängige Signaltransduktion 1.3 PI-3-Kinasen ### 2 ### FRAGESTELLUNG ### 3 ### MATERIALIEN ### 4 ### METHODEN 4.1 Proteinbiochemische Standardmethoden 4.2 Expression rekombinanter Proteine in Insektenzellen 4.3 Reinigung regulatorischer Proteine 4.4 G-Protein-Funktionsbestimmung 4.5 PI-3-Kinase-Funktionsbestimmung ### 5 ### ERGEBNISSE 5.1 Sensitivität der Klasse I PI-3-Kinasen gegenüber verschiedenen Signalwegen 5.2 Strukturelle Determinanten der Gbg-Sensitivität der PI-3-Kinasen b und -g 5.3 Funktion der p101-Untereinheit bei der Gbg-vermittelten Stimulation der PI-3-Kinase g 5.4 Proteinkinase-Aktivität der PI-3-Kinase g 5.5 Wortmannin-Sensitivität der PI-3-Kinase g 5.6 Untersuchung der Gb-Isoformspezifität der PI-3-Kinase b und -g ### 6 ### DISKUSSION 6.1 Gbg-Sensitivität von Klasse I PI-3-Kinasen 6.2 Strukturelle Determinanten der Gbg-Sensitivität der PI-3-Kinase b und -g 6.3 Funktion der p101-Untereinheit bei der Gbg-vermittelten Stimulation der PI-3-Kinase g 6.4 Gbg-Senstivität der Proteinkinase-Aktivität der PI-3-Kinase g 6.5 Gb-Isoformspezifität der PI-3-Kinase g 6.6 Gb5g2 als hochselektiver Modulator von Effektoren ### 7 ### ZUSAMMENFASSUNG ### 8 ### LITERATURVERZEICHNIS ### 9 ### EIGENE PUBLIKATIONEN ### 10 ### LEBENSLAUF ### 11 ### DANK","Klasse I PI-3-Kinasen sind wichtige ýsecond messengerý-bildende Enzyme, die an einer Vielzahl von zellulären Prozessen wie Zellwachstums- und Differenzierungsvorgängen, cytoskelettalen Veränderungen oder der Steuerung von vesikulären Transportvorgängen beteiligt sind. Um die G-Protein- Sensitivität dieser Enzymklasse besser zu verstehen, wurden die vier heterodimeren Klasse I PI-3-Kinasen auf ihre Sensitivität gegenüber Gbg untersucht. Dabei konnten die PI-3-Kinase b und -g sowohl in An- als auch in Abwesenheit ihrer jeweiligen nicht-katalytischen Untereinheit, p85 bzw. p101, durch nanomolare Konzentration von Gbg stimuliert werden. Folglich stimmt die strukturelle Einteilung der Klasse I PI-3-Kinasen in p85- und nicht p85-assoziierte Formen nicht, wie bisher angenommen, mit der Sensitivität gegenüber Rezeptor-Tyrosin-Kinasen und Gbg überein. Um die Rolle der p101-Untereinheit bei der Gbg-vermittelten Aktivierung genauer zu analysieren, wurden Gbg-Stimulationsversuche mit der monomeren (p110g) und der heterodimeren (p101/p110g) PI-3-Kinase g in Anwesenheit verschiedener Lipidsubstrate durchgeführt. Dabei zeigte sich, daß die p101-Untereinheit die Substratselektivität der Gbg-stimulierten PI-3-Kinase g beeinflußt. Einerseits wurde durch die p101 die Gbg-Stimulation der PI- Phosphorylierung gehemmt, andererseits wurde die Sensitivität der p110g für Gbg in Anwesenheit von PI-4,5-P2 stark erhöht. Dieser Mechanismus könnte teilweise eine Erklärung dafür sein, daß es nach Stimulation Gbg-sensitiver PI-3-Kinasen in vivo zur selektiven Phosphorylierung von PI-4,5-P2 und damit zur Bildung von PI-3,4,5-P3 kommt, obwohl auch PI und PI-4-P in vitro- Substrate für Klasse I PI-3-Kinasen sind. Um die Spezifität der Interaktion von Gbg mit PI-3-Kinasen zu analysieren, wurden verschiedene Gbg-Isoformen auf ihre Fähigkeit zur Stimulation der PI-3-Kinase b und -g untersucht. Während Gb1g2, Gb2g2 und Gb3g2 mit fast identischer Potenz und Effizienz die PI-3-Kinase g stimulierten, zeigte Gb5g2 keine stimulatorische Aktivität an den getesteten PI-3-Kinase-Isoformen. Dies umfaßte sowohl die Lipid- und Proteinkinase-Aktivität der PI-3-Kinase g als auch die Lipidkinase-Aktivität der PI-3-Kinase b, mit und ohne Kostimulation durch ein Tyr-phosphoryliertes p85-Bindungspeptid. Der Grund für die fehlende Stimulierbarkeit durch Gb5g2 war die fehlende Interaktionsfähigkeit zwischen Gb5g2 und der PI-3-Kinase b bzw  -g. Hieraus kann geschlossen werden, daß Klasse I PI-3-Kinasen nicht durch Gb5 reguliert werden. Die vorgestellten Untersuchungen zeigen, daß die Spezifität G-Protein- abhängiger PI-3-Kinase-Signale auf verschiedenen Ebenen determiniert ist. Auf Rezeptorebene, indem nur bestimmte PI-3-Kinase-Isoformen aktiviert werden, auf G-Protein-Ebene, da PI-3-Kinasen nur von bestimmten Gbg-Untereinheiten stimuliert werden können, und auf der PI-3-Kinase-Ebene selbst, wo die selektive Bildung von 3´-phosphorylierten Lipidprodukten die Vielfalt der auslösbaren Effekte einschränkt.","Class I PI-3-kinases are important second messenger-generating enzymes and play a role in a variety of cellular processes such as mitogenesis, cytoskeletal rearrangement or vesicular trafficking. To better understand the G protein sensitivity of these enzymes, all four heterodimeric class I PI-3-kinases were examined for their sensitivity towards Gbg. The PI-3-kinases b and -g were stimulated by nanomolar concentrations of Gbg in the presence as well as in the absence of their non-catalytic subunits, p85 and p101, respectively. Therefore the classification of class I PI-3-kinases into p85- und not p85-associated forms does not correlate with their sensitivity towards receptor tyrosine kinases and Gbg. To examine the role of p101 in Gbg-mediated activation in more detail, monomeric (p110g) and heterodimeric (p101/p110g) PI-3-kinase g were stimulated with Gbg in the presence of different lipid substrates. The experiments revealed that p101 affects the substrate preference of Gbg-stimulated PI-3-kinase g. On the one hand, p101 inhibits Gbg-stimulation of PI- phosphorylation, on the other hand it strongly increases the sensitivity of p110g to Gbg in the presence of PI-4,5-P2. This mechanism may be an explanation for the observation that Gbg-stimulation of PI-3-kinases ýin vivoý leads to a selective phosphorylation of PI-4,5-P2 and thereby to the production of PI-4,5-P3, although PI und PI-4-P are in vitro-substrates for class I PI-3-kinases. To analyze the specificity of interaction between Gbg and PI-3-kinases, distinct Gbg-isoforms were examined for their ability to stimulate the PI-3-kinases b and -g. Whereas Gb1g2, Gb2g2 and Gb3g2 stimulated PI-3-kinase g with similar potencies and efficacies, Gb5g2 showed no stimulatory activity on both PI-3-kinase isoforms. This behaviour comprised the lipid- and protein kinase activity of PI-3-kinase g as well as the lipid kinase activity of PI-3-kinase b, with or without costimulation by a Tyr-phosphorylated p85-binding peptide. The inability of Gb5g2 to stimulate PI-3-kinase b or -g was caused by lack of interaction. Thus, class I PI-3-kinases are not regulated by Gb5. The presented data show that specificity of G protein-dependent PI-3-kinase signaling is determined on different levels. On the level of receptors, because only a subset of class I PI-3-kinases are activated, on the level of G proteins, since only distinct Gbg-isoforms are able to stimulate PI-3-kinases, and on the level of PI-3-kinases, because the selective formation of 3´-phosphorylated lipid products restricts the variety of conceivable signals.","https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/1287||http://dx.doi.org/10.17169/refubium-5489","urn:nbn:de:kobv:188-2000000592","ger","http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen","signal transduction||G proteins||phosphoinositide 3-kinases","500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie","Molekulare Determinanten und Spezifität der Gbetagamma-Regulation von Klasse I Phosphatidylinositol-3-Kinasen","Molecular determinants and specificity of Gbetagamma regulation of class I phosphoinositide 3-kinases","Dissertation","free","open access","Text","Biologie, Chemie, Pharmazie","FUDISS_derivate_000000000289","FUDISS_thesis_000000000289","http://www.diss.fu-berlin.de/2000/59/"