Angiogenese ist die Neubildung von Blutgefäßen durch Sprossung von Kapillaren aus bereits bestehenden Gefäßen. Zur Erforschung der Angiogenese werden in vitro-Modelle verwendet, in denen die Migration und Proliferation der Endothel-zellen, die Bildung gefäßähnlicher Strukturen und die Bildung basalmembran-ähnlicher Strukturen beobachtet werden kann. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die einzelnen Phasen dieser in vitro-Angiogenese darzustellen. Zu diesem Zweck wurden Endothelzellen aus dem Corpus luteum in Blüte und in Rückbildung angezüchtet und in verschiedenen Stadien licht- und elektronenmikroskopisch untersucht. Die Ausbildung einer basalmembranähnlichen Struktur und ihre Anordnung zu den Endothelzellen wurde durch immunhistochemischen Nachweis der Basalmembrankomponente Laminin gezeigt. Wurden Endothelzellen neu ausgesät, dann war vor Beginn der in vitro-Angio- genese erst eine starke Proliferation der Zellen und die Kontaktaufnahme der Zellen durch lange Ausläufer zu beobachten. Mit Erreichen der Konfluenz wurden diese Ausläufer zurückgebildet und die Zellen nahmen eine polygonale Form im sogenannten Kopfsteinpflastermuster an. Den Beginn der in vitro-Angiogenese stellte, noch bevor an den Zellen selbst Veränderungen zu erkennen waren, die Deposition von Laminin in Form von kurzen, faserartigen interzellulären Strukturen dar. Nachfolgend konnte bei den Endothelzellen die erneute Ausbildung länglicher Fortsätze und die längsgerichtete Aneinanderlagerung von einzelnen Zellen beobachtet werden. In der folgenden Phase formten die Zellen einzelne, ringartige Gebilde und bildeten schließlich eine netzartige Struktur, die die gesamte Kultur umfasste. Laminin und fibrilläres Material wurde bei den ringartigen Strukturen zwischen den Zellen, vor allem aber den Ringen außen anliegend gefunden. Diese einseitige Ablagerung von basal- membranähnlichem Material wies darauf hin, dass die Zellen zu diesem Zeitpunkt eine eindeutige Polarität besaßen, wobei sich die luminale Seite nach innen, die basale Seite nach außen richtete. Größere Maschen dieses Netzwerkes konnten durch Zellsprosse geteilt werden, in deren Zentrum ebenfalls basalmembran-ähnliches Material auftrat. Dieser Vorgang wies starke Ähnlichkeit mit der in vivo in verschiedenen Geweben beobachteten Intussuzeption auf, bei der Gefäße durch Bildung von Pfeilern geteilt werden. Anschließend kam es zur Umformung des primären Netzwerkes mit Ausbildung solider Zellstränge und gleichzeitiger Rück-bildung der feineren Strukturen. Im Inneren der soliden Stränge konnte wiederum Laminin und fibrilläres Material gezeigt werden, so dass auch hier die basale und luminale Seite der Zellen eindeutig bestimmt war. Lumina scheinen durch Ausbildung intrazellulärer Vakuolen zu entstehen. Anhand einer 8 Monate alten Langzeitkultur konnte schließlich erstmals die spontane Rückbildung von zuvor entstandenen, endothelialen Strukturen beobachtet werden. Die Phasen der in vitro-Angiogenese wiesen starke Ähnlichkeiten mit der Angiogenese in vivo auf. Dies betraf die Ausbildung ring- und netzartiger Strukturen in vitro und die Formung eines primären Kapillarnetzes durch Anastomosen und Schlingenbildung der Kapillarsprossen in vivo. Die in den Zellkulturen beobachtete Bildung solider Zellstränge und Rückbildung des feineren Netzwerkes war mit der Remodellierung des primären Gefäßnetzes in reifere Strukturen mit größeren und kleineren Gefäßen vergleichbar. Ähnlichkeiten waren auch bei der Rückbildung der endothelialen Strukturen zu finden. Für die in vitro-Angiogenese scheint dabei ein Grundprogramm zu existieren, das nicht nur einen bestimmten schrittweisen, sondern auch einen zeitlichen Ablauf vorgibt. Ein weiteres Ziel der Untersuchung war, die Expression des Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), seiner beiden Rezeptoren, VEGFR-1 und VEGFR-2 und die Expression des Rezeptors für Wachstumshormon mittels PCR nachzuweisen. Alle untersuchten Proteine wurden deutlich von den untersuchten Endothelzellen exprimiert. Es schienen grundsätzlich keine signifikanten Unterschiede in der Ausprägung während der verschiedenen Phasen der Angiogenese aufzutreten. Bemerkenswert war vor allem die Expression des VEGF durch die Endothelzellen selbst. Eine besonders starke Expression zeigte der Wachstumshormon-Rezeptor. Dieses Ergebnis wies darauf hin, dass GH in die Blutgefäßentwicklung involviert sein könnte, wobei vor allem ein Einfluss auf die Proliferation der Endothelzellen über den GHR denkbar wäre.
Angiogenesis implicates the formation of blood vessels by sprouting of capillaries from existing vessels. In angiogenesis research in vitro models are used, displaying the migration and proliferation of endothelial cells, the formation of tubular structures and the deposition of basement membrane-like material. One aim of the present study was to examine the steps of in vitro angiogenesis. For this purpose endothelial cells from the midstage and the regressing corpus luteum were isolated, cultured and examined by phase contrast microscopy and electron microscopy. The formation and localization of a basement membrane-like material was shown by immunohistochemical demonstration of laminin, a basement mem-brane component. After passaging endothelial cells strongly proliferated and established contacts by long cellular protrusions. When reaching confluence, involution of these protrusions occured and the cells displayed a polygonal shape showing the so- called cobble-stone pattern. The beginning of in vitro angiogenesis was marked by depositon of laminin, that formed short intercellular fibrils. Subsequently endothelial cells began to form elongated protrusions and arranged side-by- side. In the next phase the cells re-arranged to ring-like structures and finally they developed a network, that covered the entire culture. Between the cells of these ring-like structures laminin and fibril-lary material was found, but mainly it was located at the external side of the rings. The unilateral deposition of basement mebrane-like material pointed towards a definite polarity. Larger meshes of the network could be devided by cellular sprouts, that displayed basement membrane-like material in their center. This process is called intussusception, the splitting of vessels by pillars, that has been observed in vivo in different tissues. Subsequently remodeling of the primary network led to the establishment of cellular cords whereas fine endothelial structures began to vanish. In the center of the solid cords laminin and fibrillary material could be seen, thus determinating again the basal and luminal side of the cells. Lumen formation by intracellular vacuoles was observed. For the first time the spontaneous regression of previously formed endothelial structures could be observed in a long term culture that had been maintained for eight months. The course of angiogenesis in vitro showed strong similarity with angiogenesis in vivo. The processes concerned were the formation of ring-like strucures and net-works in vitro and the building of a primary capillary mesh by anastomoses and loop formation in vivo. The formation of solid cords and the vanishing of the fine endothelial network are comparable to the remodeling of a primary vascular plexus into mature structures with larger and smaller vessels. The results of this work imply that angiogenesis in vitro is not only determined by a sequence of specific events, but also has to take place in a characteristic temporal pattern. The second aim of this study was to demonstrate the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF), its receptors VEGFR-1 and VEGFR-2 and the expression of the receptor for growth hormone by PCR. These proteins were expressed by all cells examined. No significant differences between the steps of angiogenesis were found. A remarkable result was the expression of VEGF by endothelial cells. The expression of the receptor for growth hormone was very strong suggesting that GH is involved in vessel formation, particularly influencing the proliferation of endothelial cells via the GHR.
