In vivo characterization of histone modifications in Drosophila melanogaster

Abstract

The aim of this study was to identify and characterize ‘epigenetic’ histone modifications that contribute to the regulation of cellular differentiation. In order to address this aim I used Drosophila melanogaster as a model system as it provides extensively characterized stem cell systems such as germline stem cells (GSCs) of the ovary. Screening for histone modifications that are enriched in GSCs, identified two modifications of histone H3, methylation at lysine 27 (H3K27me3) and phosphorylation at threonine 11 (H3T11ph), as canidates with a potential function in GSCs. I could then show that the methyl transferase complex that is resposible for H3K27 tri-methylation, the Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2), is necessary for the maintenance of germline and somatic stem cells in the ovary of D. melanogaster. Interestingly, the phosphorylation of H3T11 was also found to be dependent on the enzymatic activity of the PRC2 methyltransferase subunit Enhancer of zeste (E(z)) but not on the other subunits of the PRC2 complex or the modification H3K27me3. Hence, the phosphorylation of H3T11 is dependent on a previously not anticipated function of E(z) independent of the PRC2 complex. In order to further characterize the relevance of H3T11 phosphorylation in vivo I generated flies that are mutant for H3T11 (H3T11A). These individuals die during embryogenesis, therefore I analysed genetic mosaics in somatic cells of the ovary and wing imaginal disc cells. I found that introducing the H3T11A mutation in the canonical histone H3 alone was not sufficient to eliminate the H3T11ph signal from cells and that a significant portion of the H3T11 phosphorylation infact takes place on the closely related variant histone H3.3. This is in striking contrast to the methylation of H3K27, which is almost exclusively found on the canonical histone H3. Abolishing H3T11 phosphorylation from both, the canonical and the variant histone led to a significant proliferation defect and elevated levels of H3K27 methylation. Genome wide analysis of the H3T11ph modification revealed a peak like enrichment of H3T11ph at boundaries of chromatin domains that are enriched for H3K27me3 and a significant overlap of these peaks with sites that direct the assembly of chromatin insulator elements. H3T11 phosphorylation might therefore be required to limit the spread of the H3K27me3 modification across chromatin by a negative feedback mechanism involving the H3K27 methyltransferase E(z).

Das Ziel dieser Arbeit war es epigenetische Histonmodifikationen, die an der Regulation zellulärer Differenzierung beteiligt sind, zu identifizieren und zu charakterisieren. Dafür nutzte ich Drosophila melanogaster als Modellsystem, da es sich hierfür hervorragend mit zahlreichen Stammzellsystemen wie zum Beispiel der Keimbahnstammzellen der Ovare eignet. Zur Identifizierung von Histonmodifikationen, die in Keimbahnstammzellen angereichert sind, wurden Antikörperfärbungen durchgeführt, die zeigten, dass die Modifikationen von Histon H3, H3K27me3 und H3T11Ph, Kandidaten mit einer potentiellen Funktion in Keimbahnstammzellen sind. Ich konnte zeigen dass der Methyltransferase Komplex namens Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2), der für die Trimethylierung von H3K27 verantwortlich ist, notwendig für den Stammzellerhalt von Keimbahn- und somatischen Stammzellen im Ovar von D. melanogaster ist. Interessanterweise ist die Phosphorylierung von H3T11 auch abhängig von der enzymatischen Aktivität der PRC2 Untereinheit Enhancer of zeste (E(z)), aber nicht von anderen Untereinheiten des PRC2 Komplexes oder der Modifikation H3K27me3. Die Phosphorylierung H3T11 ist daher von einer bislang unbekannten Funktion von E(z) abhängig. Um die Bedeutung von H3T11ph in vivo zu charakterisieren, stellte ich Fliegen her, die mutant für H3T11 (H3T11A) sind. Diese Tiere sterben während der Embryogenese, weswegen ich genetische Mosaike in somatischen Zellen des Ovars und in Flügelimaginalscheiben analysierte. Die H3T11A Mutation alleine war nicht ausreichend, um das H3T11ph Signal in diesen Zellen zu entfernen. Ein signifikanter Anteil der H3T11ph findet auf dem Histonvariant H3.3 statt. Das steht im Kontrast zur H3K27 Trimethylierung, welche exklusiv auf dem kanonischen H3 zu finden ist. Das Entfernen von H3T11ph sowohl vom kanonischen H3 als auch vom varianten Histon H3.3, führte zu einem Proliferationsdefekt und einem erhöhten Level an H3K27me3. Genomweite Analysen von H3T11ph zeigten, dass H3T11ph an Grenzen von H3K27me3 Chromatin Domänen stark angereichert ist und dass diese Stellen mit Insulatorproteinen überlappen. Die H3T11 Phosphorylierung könnte daher dafür nötig sein, die Ausbreitung von H3K27me3 über Chromatinregionen durch einen negativen Feedback Mechanismus der H3K27 Methyltransferase E(z) zu limitieren.