The prion protein (PrP), an N-glycosylated and GPI-anchored protein, is responsible for transmissible spongiform encephalopathies. The prion pathogenesis is associated with the conformational conversion of its cellular form (PrPC) into the so-called scrapie form (PrPSc), an insoluble, partially protease-resistant isoform. PrPC is a cell surface glycoprotein of 208-209 amino acids of unknown function. 1 The role of the highly heterogeneous N-linked glycosylation is indistinct, resulting in glycosylated species with more than 50 different glycoforms. To study the role of the PrP glypiation and N-glycosylation, it is of high importance to have access to homogeneous glycosylated PrP. However, with current methods it is difficult to obtain homogeneous glycoproteins from natural sources and the synthesis of glycopeptides and glycoproteins is a very complex task. The aim of this work was to develop methods to provide access to homogeneous N-glycosylated- and GPI-anchored prion protein fragments for the semi-synthesis of PrP, which allow the evaluation of these modifications in the function, aggregation, replication and infectious properties of the prion protein. To gain access to a homogeneous N-glycosylated GPI-anchored prion protein a strategy using sequential native chemical ligation of protein-, peptide- and glycopeptide fragments was investigated. The synthesis of the required building blocks for glycopeptide synthesis and for a ligation-desulfurization strategy was successful, and the building blocks were used to generate the desired peptide- and glycopeptide thioesters. The ligation of the C-terminal PrP fragment 1 (214-231) was effective using an optimized buffer system and cysteine modified GPI-DiMan structure, but the ligation to a full GPI remains to be optimized. Additionally, PrP fragment 2 (178-213) was obtained in non-, mono- and diglycosylated forms using SPPS and a ligation-desulfurization strategy. The desired thioesters were successfully used in different ligation reactions. However these peptides showed low conversion and further improvements in future applications are required. Thus, a protection of the thiol function of Cys179 can be beneficial. The desired glycopeptides were generated bearing a glucosamine residue, but the installation of a nona-saccharide using Lansbury aspartylation was not effective. A strategy to elongate the obtained glycopeptides enzymatically using a glycan oxazolidine remains to be investigated.
Das Prion Protein (PrP) ist ein GPI-verankertes Glykoprotein, das für übertragbare schwammartige Hirnleiden (Transmissible Spongiforme Enzephalopathie [TSE]) verantwortlich ist. Die Pathologie der Prionerkrankung wird mit der konformellen Veränderung der zellulären Form (PrPC) der Prion Proteins in die sogenannte Scrapie Form (PrPSc) des Proteins assoziiert. PrPSc ist unlöslich und teilweise resistent gegenüber Proteasen. PrPC ist ein Zelloberflächenglykoprotein das aus 208-209 Aminosäuren besteht und dessen Funktion nicht bekannt ist. Mehr als 50 verschiedene Zuckerformen können am PrP verankert sein, wobei die Rolle dieser hochgradig heterogenen N-gekoppelten Glykosylierungen unklar ist. Um die Aufgabe dieser Kohlenhydrate und des GPI-Ankers genau zu studieren, ist es von hoher Wichtigkeit homogene Formen des Prion Glykoproteins zu haben. Mit heutigen Methoden ist es sehr kompliziert homogene Glykoproteine aus natürlichen Proben zu gewinnen. Außerdem ist die chemische Synthese von Glykopeptiden und Glykoproteinen eine sehr komplexe Aufgabe. Die Zielsetzung dieser Arbeit war es Methoden zu entwickeln um Zugang zu homogenen GPI-verankerten Prion Glykoproteinen zu haben und dadurch den Einfluss der verankerten Kohlenhydrate auf die Funktion, auf die Aggregation, auf die Verbreitung und auf die infektiösen Eigenschaften des Prion Proteins zu untersuchen. Die Synthese homogener N-glykosylierter GPI-verankerter Prion Proteine wurde mit Hilfe einer Strategie, die sequenzielle native chemische Ligation von Protein-, Peptid- und Glykopeptidthioester verwendet, untersucht. Nach erfolgreicher Darstellung der benötigten Bausteine für die Glykopeptidsynthese und die Ligation- Entschwefelungsstrategie wurden diese benutzt um die nötigen Peptid- und Glykopeptidthioester zu generieren. Die Ligation des C-terminalen PrP Fragments 1 (214-231) mit einer cysteine-modifizierten DiMan Struktur war nach Optimierung des Puffersystems effektiv und belastbar. Diese Bedingungen führten jedoch nicht zum gewünschten Produkt, wenn ein komplexer lipidierter GPI genutzt wurde und weitere Optimierung ist hier von Nöten. Zusätzlich wurde PrP Fragment 2 (178-213) in nicht-, mono- und diglykosylierten Formen mit Hilfe einer SPPS und Ligation-Entschwefelungsstrategie dargestellt. Die dargestellten Thioester wurden erfolgreich in verschiedenen Ligationen verwendet. Um die geringe Umsetzung der Thioester in zukünftigen Anwendungen zu verbessern, ist die permanente Schützung des Cysteins 179 von höchster Bedeutung. Während der Darstellung der Glykopeptide zeigte sich die Installierung eines Glukosamins effektiv, während ein eigens isoliertes Nonasaccharid nicht mit Hife der Lansbury Kopplung installiert werden konnte. Für die Zukunft erscheint hier die enzymatische Verlängerung der synthetisierten Glykopeptide mit Hilfe eines Glykanoxazolidin geeignet.
