Untersuchungen zur biologischen Funktion der α3-cytoplasmatischen Domäne des α3β1-Integrins und deren Einfluss auf die Aktivierung der kleinen GTPasen Rac1 und RhoA in PC12-Zellen

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde die Beteiligung des α3β1-Integrins an der Adhäsion, der Zell-Proliferation sowie beim Auswachsen von Neuriten in PC12-Zellen unter besonderer Berücksichtigung der α3-cytoplasmatischen Sequenz des α3β1-Integrins untersucht. PC12-Zellen exprimieren das α3β1- und das α1β1-Integrin, nicht aber das dem α3β1 sehr ähnlichen α6β1-Integrin. Während das α1β1-Integrin Zell-Matrix- Adhäsion und das Auswachsen von Neuriten auf Kollagen IV und Laminin-1 unterstützt, spielt das α3β1-Integrin bei der Adhäsion auf seinen Liganden Laminin-5 und Laminin-1 nur eine untergeordnete Rolle, während es für das Auswachsen der Neuriten auf diesen Matrixproteinen essentiell ist. In Untersuchungen zur Funktion der α3-cytoplasmatischen Sequenz des α3β1-Integrins wurden chimäre Rezeptoren, die aus der extrazellulären Domäne des IL2-Rezeptors und der α3-cytoplasmatischen Sequenz des α3β1-Integrins bestehen, in einem negativ-dominanten Ansatz verwendet. Untersuchungen mit diesen chimären Proteinen ergaben, dass die cytoplasmatische α3-Sequenz notwendig für die Integrin-abhängige Zell- Proliferation sowie für das Neuritenwachstum ist. IL2R-α3-transfizierte Zellen wiesen eine gesteigerte Proliferationsrate auf und waren nicht in der Lage, nach NGF-Stimulation Neuriten auszubilden. Die endogene α3-Sequenz wirkt somit offensichtlich Proliferations-hemmend und Differenzierungsfördernd. Mit Hilfe von pharmakologischen Inhibitoren und geeigneten cDNA-Konstrukten konnte gezeigt werden, dass die Hemmung der Differenzierung durch die IL2R-α3-Chimäre möglicherweise auf einer Störung des Crosstalks zwischen den kleinen GTPasen RhoA und Rac1 beruht. Es ist beschrieben, dass Rac1 im Verlauf des Neuritenwachstums aktiviert wird, während der RhoA-Signalweg inaktiviert werden muss. Die Kotransfektion von konstitutiv aktivem Rac in IL2R-α3-transfizierten Zellen induzierte die Bildung von Filopodien, nicht aber die Bildung von Neuriten, während dominant negatives Rac1 komplett die Ausbildung von Zell- Ausläufern inhibiert. Die Blockierung der RhoA-Kinase ROKα durch den pharmakologischen Inhibitor Y27632 konnten den durch IL2R-α3 hervorgerufenen dominant negativen Effekt in PC12-Zellen auf Laminin-5 und Laminin-1 aufheben. Die sich bildenden Neuriten waren jedoch dünner als die in Wildtyp-Zellen. Erst die Gabe des ROK- Inhibitors bei gleichzeitiger Transfektion von konstitutiv aktivem Rac erzeugt einen Phänotyp, der den differenzierten Wildtyp-Zellen sehr ähnlich ist. Dies weist darauf hin, dass die cytoplasmatische Sequenz vor allem an der Inaktivierung des RhoA-Signalweges beteiligt ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die cytoplasmatische Sequenz der α3 -Integrin-Untereinheit einen Einfluss auf die Aktivierung der MAPK- Signalkaskade besitzt.

This thesis presents data on α3β1-integrin mediated cell adhesion, proliferation and neurite outgrowth of PC12-cells was investigated with respect to α3-cytoplasmic sequence. PC12-cells express α3β1- and α1β1-, but not α6β1-integrin which is similar to α3β1-integrin. α1β1-integrin mediates cell adhesion und neurite outgrowth to collagen IV and laminin-1, while α3β1-integrin plays only a minor role in adhesion to its ligands laminin-5 and laminin-1. However it is essential for neurite outgrowth on both matrices. In this study the function of the α3-cytoplasmic sequence of α3β1-integrin was analysed using as a dominant negative approach chimeric receptors consisting of the extracellular domain of the IL2-receptor and the intracellular sequence of the α3-integrin. Investigations with these chimeric proteins revealed that the α3-cytoplasmic tail is necessary for integrin-dependent cell proliferation and neurite outgrowth. Cells transfected with this receptor showed an increase in proliferation and were able to form neurites after NGF stimulation. Therefore the endogenous α3-sequence apparently inhibits proliferation and promotes differentiation. Using pharmacological inhibitors and suitable cDNA constructs, it could be shown that the inhibition of the differentiation via the IL2R-α3 chimera is possibly based on a disturbance of the crosstalk between the small GTPases RhoA and Rac1. It is described that Rac1 is activated during neurite outgrowth while RhoA-signal pathway has to be inactivated. Cotransfection of constitutive active Rac1 in IL2R-α3 transfected-cells induced the formation of filopodia, but not the formation of neurites, while dominant negative Rac1 completely inhibits formation of cell extensions. Blocking of RhoA-kinase ROKα using the pharmacological inhibitor Y27632 eliminated the dominant negative effects of IL2R-α3 constructs in PC12-cells on laminin-5 and laminin-1. Nevertheless, these just formed neurites were thinner than the neurites of wildtype cells. Only the combination of ROKα-inhibitor and simultaneous transfection with constitutive active Rac1 resulted in a phenotype that is comparable to the phenotype of differentiated wildtype cells. This indicates that the cytoplasmic sequence is mainly engaged in inactivation of RhoA-signalling pathway. It could be shown further that the cytoplasmic sequence of α3-integrin subunit influences the activation of MAPK signalling cascades.