Summary Over the past decades multi-resistant Enterobacteriaceae like Extended-spectrum beta-lactamases (ESBL)-producing Escherichia (E.) coli have become a major challenge to infection control both in human and veterinary medicine. The spread of antimicrobial resistance occurs mainly by the acquisition of mobile genetic elements like resistance plasmids or the clonal spread of multi-resistant lineages. Most of the resistance genes in pathogens have evolved originally in long periods of evolution in environmental bacteria like the ESBL-enzyme family blaCTX-M which presumably originates from a soil Kluyvera species. Apparently within a half century of usage of antimicrobials in human and veterinarian clinics, the environmental resistome has made its way into bacteria of clinical importance. However, within the last years it became obvious that we have to consider the other side of the medal of this development as well: the transmission of pathogenic and now multi-resistant bacteria and/or their resistance genes back to the environment and subsequently to wildlife. My habilitation thesis focuses on multi-resistant E. coli as a prototype species for the spread of antimicrobial resistance into wildlife. E. coli represents a commensal of the gut of many birds and mammals including humans. Due to its omnipresence in faeces it is distributed to the environment where it can survive as well. For these reasons it has a long tradition as indicator bug of faecal pollution. Despite its commensal character E. coli is frequently implicated in intestinal and extra-intestinal infectious diseases the treatment of which requires the use of anti- infectives. Furthermore multi-resistant E. coli especially ESBL-producers are among the “super bugs” with pose a major threat to public health due to limited treatment options in case of infectious diseases. Summing up, this makes E. coli an ideal paradigmatic candidate for my research. In contrast to the wealth of studies dealing with ESBL-producing E. coli, be it in human, veterinary medicine or livestock breeding their presence and impact on the microbiota of wildlife has been addressed rarely. Nevertheless, due to the work of a small number of groups including my own wildlife has gained more attention in the last years as the occurrence of ESBL-producing E. coli in wildlife could implicate consequences like new reservoir functions and transmission pathways with impact on human and animal health due to the zoonotic potential of E. coli. My initial studies aimed at gaining detailed information on the host distribution of multi-resistant E. coli in avian and small mammal wildlife species. Two avian groups were identified as highly prevalent carriers of multi-resistant E. coli, namely birds of prey and waterfowl. But as we also observed passerines and other avian groups so the carriage of multi-resistant E. coli does not seem to be restricted, pointing towards the absence of host species dependence. The resistance patterns of the avian isolates are comparable to the ones that have been reported for livestock in Europe. Interestingly, in our study on rural rodents we found lower numbers of multi-resistant E. coli compared to rural birds (2% vs. 5%). Nevertheless, similar to the results of the avian study the resistance pattern of the rodent-borne E. coli was comparable to the common antimicrobial resistances observed among E. coli from swine, poultry or cattle. Additionally we found a correlation between antimicrobial resistance of E. coli isolates in wild mice and livestock densities for Germany. This corroborates the idea of some kind of environmental pollution with multi-resistant E. coli by farming and livestock breeding practises resulting in higher rates of multi-resistant bacteria in rodents. Our initial screening study on urban rats supported the theory of an influence of synanthropism on carriage rates of multi-resistant bacteria in wildlife as 13.6% of the rat population carried multi-resistant E. coli. The initial screening studies as the first part of my work revealed that a broad range of mammal and avian species can carry multi-resistant E. coli. Furthermore, the position of the host in the food chain and its general feeding behaviour seem to be influential factors. Moreover among the multi- resistant isolates we observed a frequent combination of resistance with phylogenetic backgrounds related to virulence and the possession of genes associated with extra-intestinal virulence. During the second part of my work I concentrated on ESBL-producing E. coli. This enabled a deep characterization and comparison to isolates of human and animal origin. Among the isolates from avian hosts we detected a clonal lineage of E. coli of the sequence type ST648. This sequence type seems to be associated with ESBL-producing E. coli in human and veterinary medicine worldwide. Additionally, we described an ESBL-producing C. freundii strain from a Tawny owl, which was the first description of an ESBL-producing Citrobacter in wildlife. The detailed characterization of several rat borne ESBL-producing E. coli revealed the presence of a pandemic ESBL-producing E. coli lineage with high extraintestinal virulence. At this time point our work was the first to describe the B2-O25b-ST131 pandemic ESBL-producing E. coli lineage in urban rats and furthermore in wild mammals in general. Another ESBL-producing E. coli obtained from a rat presented a hybrid strain that paradigmatically combined multi-resistance and high extraintestinal pathogenicity. The isolate belonged to one of the most virulent ExPEC (extraintestinal pathogenic E. coli) lineages (ST95) and proofed its pathogenicity in an animal infection model. These finding gave initial evidence of a possible role of urban rodents as hosts of ESBL-producing E. coli with a high extraintestinal virulence potential. The types of ESBL enzymes as well as the phylogenetic background of the ESBL-producing E. coli characterized from wildlife overlap largely with those ESBL enzymes dominant in isolates from human and veterinary patients. As shown for ST131 even identical clonal lineages are present underlining the zoonotic character of ESBL-producing E. coli. In the last part of my work I used selective isolation methods to verify the carriage rates of ESBL- producing E. coli in wildlife. In one study comparing birds of prey from remote and human influenced areas we obtained a carriage rate of ESBL- producing E. coli of 5 % independent from where the isolates originated from, namely Germany or Mongolia. The Mongolian birds were sampled in the Gobi desert, an area with no considerable human and livestock populations and absence of agriculture. These findings point towards a contribution of avian migration to the transmission of multi-resistant bacteria in this remote area as it is very unlikely that the birds picked up the strain locally by the time of sampling. The characterization of ESBL-producing E. coli from birds of prey isolated in Mongolia and Germany as well as the ones from urban brown rats (R. norvegicus) identified clonal lineages that represent clinical relevant isolates with a clear zoonotic potential. In urban rats of the species R. norvegicus we furthermore found alarming high rates with of 16% of all animals carrying an ESBL-producing E. coli. These rates exceeded those which have recently been reported for healthy individuals from comparable urban settings (5% - 8%), but were similar to the ESBL-producing E. coli rates reported in hospitalized patients or their household contacts (12% - 16%). Urban rats might therefore present a sentinel and a possible vector within urban transmission cycles and could become a permanent environmental source of zoonotic and multi-resistant E. coli. Both the clear influence of synanthropism as demonstrated by the high rates of ESBL-producing E. coli in R. norvegicus, as well as still substantial carriage rates in remote areas in the birds underlined the need for holistic approaches, comprising humans, animals and the environment to explore putative transmission cycles of multi- resistant ESBL-producing E. coli. In addition it perfectly depicts the importance of the “One Health” initiative. As a first step in this direction we comparatively characterized ESBL-producing E. coli of avian origin and belonging to phylogenetic group D-and sequence type (ST) 648 producing CTX-M-type ESBLs together with isolates from companion animals, livestock and humans. We were able to proof a pandemic occurrence of the same clonal lineages of D-ST648-ESBL-producing E. coli independent from the host. This finding highlights the possibility of interspecies transmission notably from human to companion and wild animals and vice versa. Besides these public health issues another dimension should be kept in mind. The widespread occurrence of ESBL-producing E. coli in wildlife, even though these animals have never been exposed continuously to antimicrobials, weakens the presumption of a decline of resistance with the absence of antimicrobial selection pressure alone. The theory of a “burden of resistance” might be of overestimated importance at least for some specific multi-resistant E. coli lineages like ST131 or ST648. The frequent observation of a combination of multi-resistance with the possession of genes associated with extraintestinal virulence in the wildlife isolates could be one explanatory approach for the success of ESBL- producing E. coli in wildlife and other non-resistance factors might be of equal importance. Based on my data it seems reasonable that future research in this field should focus on two areas. First of all detailed epidemiological approaches are needed as most of the current data is not representative, enabling only preliminary insights. The widespread occurrence of ESBL- producing E. coli in wildlife hosts has been proven by my work and others showing that wildlife might serve as sentinel for the spread of antimicrobial resistance in the environment. Future epidemiological studies should therefore concentrate on holistic approaches either on (I) explicit synanthropic species like rats and possible urban transmission pathways as the chances of transmission are higher due to spatial proximity of wildlife and humans or (II) on a global scale on intercontinental migratory birds as their mobility range and numbers is comparable to international travel. Additionally it will be important to screen for the arrival of AmpC- and or carbapenemase- producing E. coli in wildlife populations, as their importance in the clinical field is rising and their appearance in the environment seems only a question of time. Secondly we need a detailed molecular characterization of ESBL- producing E. coli in wildlife to understand the success of multi-resistant bacteria in non-clinical settings which might have implications for the treatment of multi-resistant bacteria in the clinics as well. Studies in this context should verify (I) basic questions of host-pathogen interaction of ESBL-producing E. coli like colonization and shedding and (II) elucidate the influence of non-resistance and/or fitness factors like metabolism, adhesion or motility on the success of ESBL-producing E. coli in the environment. As first studies clearly point toward the existence of such contributing factors my future work will focus on these areas.
Zusammenfassung Sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin sind multiresistente Enterobacteriaceae, wie z. B. Extended-Spektrum beta-Laktamase (ESBL)-produzierende Escherichia (E.) coli, zu einer großen Herausforderung bei der Bekämpfung von Infektionskrankheiten geworden. Die beiden Hauptverbreitungswege antimikrobieller Resistenz stellen dabei die Aufnahme mobiler genetischer Elemente sowie die klonale Verbreitung bestimmter multiresistenter Bakterien-Linien dar. Ein Großteil der eigentlichen Resistenz-Gene hat sich dabei ursprünglich in langen Evolutions-Perioden in Umweltbakterien entwickelt. Ein Beispiel dafür ist die ESBL-Enzymfamilie blaCTX-M für welche gezeigt werden konnte, dass sie ursprünglich aus einer Spezies des Bodenbakteriums Kluyvera stammt. Die Vermutung liegt nahe, dass der nunmehr 60 Jahre währende Einsatz von antimikrobiellen Wirkstoffen im klinischen Alltag dazu geführt hat, dass Gene des Umwelt-Resistoms ihren Weg in Bakterien von klinischer Bedeutung gefunden haben. In den letzten Jahren zeigte sich jedoch dass diese Entwicklung durchaus bidirektional ist, also pathogene und mittlerweile multiresistente Stämme-oder deren Resistenz-Gene- auch zurück in die Umwelt und nachfolgend in Wildtiere übertragen werden können. Als Prototyp für die Verbreitung antimikrobieller Resistenz bei Wildtieren werden im Rahmen dieser Habilitationsschrift hauptsächlich multiresistente E. coli behandelt. Ein Grund dafür liegt in der Omnipräsenz von E. coli als kommensaler Darmbewohner vieler Vögel und Säugetiere inklusive des Menschen. Dadurch gelangt E. coli über Fäzes in der Umwelt, in der es ebenfalls überleben kann, was wiederum seine jahrzehntelange Nutzung als Indikatorkeim für fäkale Verschmutzung begründet. Es ist allerdings hervorzuheben, dass E. coli nicht nur einen kommensalen Charakter besitzt, sondern auch als Ursache einer Vielzahl verschiedener intestinaler und extraintestinaler Infektionskrankheiten beschrieben wurde. Für deren Bekämpfung wiederum müssen teilweise Antiinfektiva eingesetzt werden. Gerade multiresistente E. coli insbesondere ESBL-Produzenten werden dabei zu den „Super-Bugs“ gezählt, deren Auftreten eine große Bedrohung der Allgemeinen Gesundheit darstellen, da für sie nur stark eingeschränkte Therapieoptionen zur Verfügung stehen. Zusammenfassend führt dies dazu dass die Spezies E. coli einen idealen paradigmatischen Kandidat für die Thematik dieser Habilitationsschrift darstellt. Im Gegensatz zu der Vielzahl an Studien welche sich mit ESBL-produzierenden E. coli in Human- und Veterinärmedizin sowie in der Tierhaltung beschäftigen, ist das Vorhandensein dieser Erreger und ihr Einfluss auf die Mikrobiota bei Wildtieren bisher sehr wenig untersucht. Nichtsdestotrotz führte die Arbeit einiger weniger Gruppen dazu, dass in den letzten Jahren auch das Vorkommen von ESBL-produzierenden E. coli in Wildtieren mehr wissenschaftliche Aufmerksamkeit erhielt. Dies liegt dara, dass dieses Vorkommen immense Auswirkungen in Bezug auf neue Reservoir- Funktionen und Transmissionswege mit Einfluss auf die die Human- und Tiergesundheit haben könnte, was im zoonotischen Potential von E. coli begründet liegt. Im Rahmen meiner initialen Studien zur Thematik versuchte ich daher zuerst detaillierte Information zum Vorkommen multiresistenter E. coli bei verschiedenen aviären und mammalen Wirtsspezies zu sammeln. Dabei konnten zwei aviäre Gruppen als hochprävalente Träger multiresistenter E. coli identifiziert werden: Greif- und Wasservögel. Da wir allerdings auch multiresistente E. coli u.a. in Singvögeln detektieren konnten, spricht dieses Gesamtbild gegen eine Wirtsspezifität multiresistenter E. coli. Die Resistenz- Muster der aviären Isolate waren dabei vergleichbar mit denen welche bereits für Isolate aus Nutztieren in Europa publiziert worden waren. Weiterhin zeigte sich im Rahmen dieser Studien das die Trägerschaft multiresistenter E. coli in Nagern aus ländlichen Naturräumen niedriger war als bei Vögeln aus vergleichbaren Gebieten (2% vs. 5%). Trotzdem zeige sich auch bei den Nagern das die Muster der Resistenzverteilung vergleichbar zu der Situation bei Schweinen, Geflügel und Rindern waren. Zusätzlich zu den bereits oben beschriebenen Ergebnissen konnten wir eine Korrelation zwischen dem Vorkommen antimikrobieller Resistenz bei E. coli–Isolaten aus Wildmäusen und der Nutztierdichte in Deutschland belegen. Dieses Ergebnis bekräftigt die Vermutung das Praktiken in der Landwirtschaft und Nutztierhaltung zu einer Art Umweltverschmutzung durch multiresistente Erreger führen könnten, was wiederum in höheren Raten dieser Erreger in wildlebenden Nagern in ländlichen Gebieten führt. Unsere erste Studie zu urbanen Nager-Populationen unterstützt weiterhin die Theorie eines Einflusses der Synanthropie einer Wirtsspezies auf die Trägerschaft von multiresistenten Bakterien bei Wildtieren, da wir eine hohe Trägerschaft von 13.6% bei urbanen Ratten feststellen konnten. Zusammengefasst lässt sich sagen, dass die Studien die während der ersten Phase meiner Arbeit durchgeführt wurden eine breite Verteilung an Säuger- und Vogelspezies zeigten welche multiresistente E. coli trugen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass andere Einflussfaktoren auf die Trägerschaft multiresistenter Erreger die Position in der Nahrungskette und das generelle Ernährungsverhalten darstellen. Außerdem zeigte sich dass die von uns gefundenen multiresistenten Isolate häufig eine Kombination aus Resistenz und Virulenz besaßen und dabei zusätzlich einen phylogenetischen Hintergrund hatten welcher mit extraintestinaler Virulenz assoziiert ist. Der zweite Teil meiner Arbeit konzentrierte sich hauptsächlich auf ESBL-produzierende E. coli. Diese scheinbare Einschränkung ermöglichte eine hoch detaillierte Charakterisierung dieser Stämme sowie einen genauen Vergleich zu Isolaten aus der Human- und Veterinärmedizin. Unter anderem konnte so eine klonale Linie von ESBL- Produzenten des Sequenztyps (ST) 648 in aviären Wirten nachgewiesen werden. Dieser Sequenztyp scheint weltweit mit ESBL-produzierenden E. coli in Human- und Veterinärmedizin assoziiert zu sein. Weiterhin konnte eine ESBL- produzierender C. freundii Stamm in einer Eule nachgewiesen werden, was gleichzeitig die Erstbeschreibung eines ESBL-produzierenden Citrobacter aus Wildtieren darstellte. Weiterhin wurden im Rahmen von Studien zur Untersuchung von urbanen Rattenpopulationen verschiedene ESBL-produzierende E. coli charakterisiert. Dabei konnten wir eine pandemische, stark extraintestinal- virulente ESBL-E. coli Linie (B2-O25b-ST131) erstmals in wildlebenden Säugern nachweisen. Ein weiterer Stamm der aus diesen Studien hervorging war ein Hybridstamm welcher paradigmatisch Multiresistenz mit einer starken extraintestinalen Pathogenität vereinte. Der Stamm gehörte zu einem der virulentesten ExPEC (extraintestinal pathogene E. coli) Sequenztypen (ST95) und wir waren in der Lage seine in vivo Pathogenität in einem Tiermodell zu zeigen. Diese Ergebnisse waren erste Hinweise darauf, dass urbane Nager- Populationen einen wichtigen Wirt für ESBL-Produzenten darstellen könnten welche gleichzeitig ein hohes extraintestinales Virulenz-Potential besitzen. Weiterhin zeigte die detaillierte Charakterisierung der ESBL-produzierenden Isolate aus Wildtieren eine hohe Übereinstimmung zu klinischen Isolaten aus Human- und Veterinärmedizin in Bezug auf deren phylogenetischen Hintergrund und die Typen der ESBL-produzierenden Enzyme. Für den ST131 konnte zudem das Vorhandensein identischer klonaler Linien in klinischen Isolaten und Wildtieren gezeigt werden, was das große zoonotische Potential von ESBL- produzierenden E. coli unterstreicht. Um die tatsächlichen Raten an ESBL- Trägerschaft in verschiedenen Wildtierspezies zu ermitteln nutzte ich im letzten Teil meiner Arbeit selektive Isolationsmethoden. In einer Studie wurden dabei Greifvögel-Isolate aus vom Menschen unterschiedlich beeinflussten Regionen gewonnen: der Mongolei als abgelegenes Gebiet und aus Deutschland. Unabhängig von der Herkunft konnten wir für beide Regionen eine ESBL- Trägerschaft von circa 5% in den Greifvögeln detektieren. Die mongolischen Vögel stammten dabei aus der Wüste Gobi, einem Gebiet mit zahlenmäßig vernachlässigbaren Human- und Nutztierpopulation und fehlender Landwirtschaft. Diese Ergebnisse deuten auf einen Beitrag des Vogelzugs bei der Ausbreitung multiresistenter Erreger in dieser entlegenen Region hin, da es sehr unwahrscheinlich erscheint dass die ESBL-produzierenden E. coli während der Zeit der Untersuchung vor Ort von den Vögeln aufgenommen wurden. Des Weiteren ist zu erwähnen dass wir sowohl in dieser Greifvogel-Studie als auch in der nachfolgend näher beschriebenen Ratten-Prävalenzstudie klonale Linien von ESBL-Produzenten nachweisen konnten, die klinisch relevante Isolate mit einem starkem zoonotischem Potential darstellen. Bei urbanen Ratten der Spezies R. norvegicus fanden wir zudem alarmierend hohe Raten (16%) an Tieren die einen ESBL-Produzenten trugen. Diese Raten übersteigen die normale Trägerschaft bei gesunden Mitteleuropäern in vergleichbaren urbanen Umfeld (5-8%), sind aber vergleichbar mit den Raten bei Krankenhauspatienten sowie deren Kontaktpersonen (12-16%). Deshalb könnten urbane Ratten sowohl als Sentinel als auch als möglicher Vektor innerhalb urbaner Transmissionszyklen dienen und des Weiteren im Laufe der Zeit zu einer permanenten Quelle für zoonotische und multiresistente Erreger aus der Umwelt werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sowohl der Einfluss der Synanthropie des Wirtes, der sich in den hohen Raten an ESBL-produzierenden E. coli in R. norvegicus wiederspiegelt, als auch die immer noch recht hohen Raten an ESBL-Produzenten in abgelegenen Regionen deutlich machen, dass holistische Forschungsansätze, die den Menschen, Nutz- und Haustiere aber auch die Umwelt und Wildtiere miteinbeziehen, nötig sind um mögliche Transmissionswege multiresistenter ESBL-produzierender E. coli nachzuweisen. Weiterhin zeigen diese Ergebnisse die hohe Bedeutung der “One Health“ Initiative. Als ein erster Schritt in diese Richtung wurde im Rahmen dieser Arbeit eine vergleichende Untersuchung von ESBL-Produzenten des Sequenztyps (ST)648 durchgeführt, der Isolate aus Wild, Nutz-und Heimtieren aber auch klinische humane Isolate umfasste. Wir konnten im Rahmen dieser Studie ein wirtsunabhängiges globales Vorkommen dieses Sequenztyps nachweisen. Dies unterstreicht die hohe Wahrscheinlichkeit eine Interspezies-Transmission von Mensch zum Tier und vise versa. Neben diesen Implikationen die vor allem des Gebiet „Public Health“ betreffen darf ein anderer Aspekt der Ergebnisse meiner Studien nicht unbeachtet bleiben. Das häufige Vorkommen multiresistenter ESBL-produzierender E. coli bei Wildtieren die keinerlei kontinuierlich Kontakt mit Antibiotika hatten spricht gegen einen Rückgang von Resistenzen nur durch das bloße Wegfallen eines antibiotischen Selektionsdrucks. Die Theorie des sogenannten “Burden of resistance”, also des Fitnessverlusts resistenter Stämme, scheint für zumindest einige spezifische multiresistente klonale Linien wie ST131 oder ST648 nicht oder vermindert zuzutreffen. Dabei könnte die bereits erwähnte bei Wildtier-Isolaten häufige Kombination von Multiresistenz und Virulenz ein möglicher Erklärungsansatz für den Erfolg von ESBL-produzierender E. coli bei Wildtieren sein. Ausgehend von den Ergebnissen meiner Arbeit erscheint es zielführend zukünftige Forschungsaktivitäten auf zwei Gebiete zu fokussieren. Zum einen sind dringend detaillierte epidemiologische Studien zur Verbreitung von ESBL-produzierenden E. coli in der Umwelt nötig, da alle bisherigen Studien lediglich nicht-repräsentative erste Einsichten erlauben. Das häufige Vorkommen ESBL-produzierender E. coli in wildlebenden Wirten wurde u.a. durch meine Arbeiten nachgewiesen, und damit auch deren Eignung als Sentinel für die Verbreitung multiresistenter Stämme in der Umwelt. Zukünftige epidemiologische Studien sollten sich daher auf holistische Ansätze zu (I) explizit synanthropen Spezies wie Ratten und urbane Transmission-Zyklen konzentrieren sowie (II) auf dem globalen Level den interkontinentalen Vogelzug näher untersuchen, da dieser vergleichbare Individuen-Zahlen wie die Internationale Luftfahrt aufweist. Ein zweiter wichtiger Ansatzpunkt zukünftiger Arbeiten ist die genaue funktionelle molekulare Charakterisierung ESBL-produzierender E. coli aus Wildtieren, um deren Erfolg auch außerhalb klinischer Umgebungen zu verstehen. In diesem Kontext sollten Studien (I) grundsätzliche Fragen zur Wirts-Pathogen Interaktion, wie Kolonisierung und Ausscheidung klären und (II) den Einfluss von Nicht-Resistenzfaktoren und/oder Fitnessfaktoren wie Metabolismus, Adhäsion und Motilität auf den Erfolg von ESBL-produzierenden E. coli untersuchen. Da erste Ergebnisse von Studien in diese Richtung deuten werde ich meine zukünftigen Arbeiten auf dieses Gebiet fokussieren.
