Synthetic Oligosaccharides as Tools to Investigate Bacterial Capsular Polysaccharides and Teichoic Acids

Abstract

Bacterial polysaccharides represent a diverse range of macromolecules that include peptidoglycans (PGs), lipopolysaccharides (LPSs), teichoic acids (TAs) and capsular polysaccharides (CPSs). Their functions range from structural cell-wall components, important virulence factors, to permitting the bacterium to survive in harsh environments. Identifying and harnessing their structural and functional features of bacterial polysaccharides offers excellent opportunities for developing new vaccines and diagnostics in the fight against severe infectious diseases, such as sepsis, pneumonia, anthrax and tuberculosis. As major virulence factors, CPSs which consist of repeating units (RUs) have been investigated to confer immunological protection against the pathogens. To date, several licensed vaccines based on isolated CPSs are available against pathogenic bacteria such as Streptococcus pneumoniae. One major obstacle in current vaccine manufacture is the isolation and purification of pure CPSs from pathogens in sufficient scale. As the pertinent immunogenic epitopes comprise only part of the polysaccharides, synthetic oligosaccharides with defined structures have emerged as an attractive option with the potential to understand glycan immunology and rationally engineer efficacious vaccines. In the first part of this work, a unique design aspect was considered to develop novel semisynthetic glycoconjugate vaccine candidates wherein RUs were bridged using an aliphatic spacer via an amide linkage (Figure 1), thereby eliminating the laborious and challenging glycosidic linkage formation. The branched tetrasaccharide RU of CPS from S. pneumoniae serotype 14 (ST-14), which was reported as the smallest core structure required to induce specific antibodies, has been chosen as the target to synthesize spacer bridged oligosaccharide derivatives. These synthetic CPS fragment derivatives were conjugated to carrier protein CRM197 to obtain vaccine candidates against ST-14. The immunological evaluation of these novel glycoconjugates was carried out in mice. Figure 1: Schematic structure of (A) natural capsular oligosaccharide and (B) spacer bridged RUs. Along with CPSs, TAs are also viable targets that can be used to fight against disease caused by Gram-positive bacteria. The most common repeating units of wall teichoic acids (WTAs) are glycerol-phosphate (GroP) or ribitol-phosphate (RboP). The hydroxyls of GroP and RboP are usually tailored with cationic D-alanine esters and monosaccharides, commonly glucose or N-acetylglucosamine. Particularly, nearly all the RboP units in Staphylococcus aureus contain O-GlcNAc. In order to better understand their roles and functions, a fragment of WTA, trimer of RboP, was synthesized to decipher their biosynthesis process in the second part of this work. The synthetic fragment was soaked into the TarP glycosyltransferase, which has been recently discovered to modify RboP with O-GlcNAc in S. aureus, to characterize their binding domain (Figure 2). Structure-guided mutagenesis experiments of TarP identified critical residues for enzyme activity. Figure 2: Interaction of active site residues of TarP with synthetic trimer of RboP. OMIT map of synthetic trimer of RboP (contoured at 3 σ) is provided (Inset). Access to large amount of well-defined oligosaccharides is a prerequisite for understanding their roles in biological process of the pathogen, thereby combating the harmful bacteria. Despite the progress that has been made in carbohydrate chemistry, still very little is known about controlling glycosylation reactions as the reaction conditions, which are developed for one substrate, are not amenable or general enough for others as would be in the case of peptide and oligonucleotide synthesis. Efforts have been made from two different angles in order to better understand the whole process of glycosylation reaction in this work. The inexpensive reagent, 1,3-dibromo-5,5-dimethylhydantoin (DBDMH), has been demonstrated to be a powerful promoter for the activation of thioglycosides both in solution and in automated glycan assembly on solid phase in chapter 4 (Figure 3). A variety of glycosyl donors containing diverse protecting groups have been investigated with promising results, while the stereoselectivity follows reported trends. Compared with N-iodosuccinimide (NIS), which is a common method for thioglycoside activation, this promoter is readily available, highly soluble, and shelf-stable. Figure 3: 1,3-Dibromo-5,5-dimethylhydantoin (DBDMH) as promoter for thioglycosides. Along the same line, chapter 5 gives an insight into the mechanism behind glycosylation reaction in depth by catching glycosyl cations using ultra-cold infrared spectroscopy. It is generally accepted that the reaction involves oxocarbenium ions as intermediate, which, however, have not been observed yet. To get empirical evidence for the mechanism, a library of monosaccharide donors with different protecting-group patterns has been synthesized to generate and characterize their glycosyl cations by cold-ion infrared spectroscopy. Thus if one understands the process of glycosylation on a molecular level, a universal method might be able to be developed, which could immensely facilitate the advent of glycoscience.

Zu den bakteriellen Polysacchariden gehört eine Vielzahl an Makromolekülen, unter anderem Peptidoglycane (PGs), Lipopolysaccharide (LPs), Teichonsäuren (TAs) und Kapselpolysaccharide (CPSs). Diese können zum Beispiel als strukturelle Komponenten der Zellwand oder als wichtige Virulenzfaktoren dienen oder dem Bakterium ein Überleben auch unter schwierigen Bedingungen ermöglichen. Können die strukturellen und funktionalen Eigenschaften der bakteriellen Polysaccharide identifiziert und nutzbar gemacht werden, bietet dies exzellente Möglichkeiten zur Entwicklung neuer Impfstoffe und diagnostischer Hilfsmittel im Kampf gegen Infektionskrankheiten wie Sepsis, Pneumonie, Anthrax und Tuberkulose. CPSs sind als wichtige Virulenzfaktoren, die aus sich wiederholenden Einheiten (repeating units, RUs) aufgebaut sind, besonders interessant für die Impfstoffentwicklung. Derzeit sind mehrere Impfstoffe gegen pathogene Bakterien wie Streptococcus pneumoniae, die auf isolierten CPSs basieren, auf dem Markt. Eine große Hürde für die moderne Impfstoffherstellung ist dabei die Isolierung und Aufreinigung der CPSs von Krankheitserregern in hinreichendem Maßstab. Da nur ein Teil der Polysaccharide eines Bakteriums auch relevante und immunogene Epitope darstellen, gewinnen synthetische Oligosaccharide mit definierter Struktur an Bedeutung. Diese können als eine attraktive Grundlage dienen, die Immunologie der Glycane besser zu verstehen und effiziente Impfstoffe zu entwickeln. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden RUs eines Polysaccharids unter Zuhilfenahme eines aliphatischen Spacers über Amidbindungen verknüpft (Abbildung 1). Dieses neuartige Design erlaubt die Entwicklung semisynthetischer Glycokonjugat-Impstoffe und umgeht dabei die aufwändigen und anspruchsvollen Glycosylierungsreaktionen. Als erstes Zielmolekül für die Synthese dieser über einen Spacer verknüpften Polysaccharide wurde die aus einem Tetrasaccharid bestehende, verzweigte RU des CPS von S. pneumoniae Serotyp 14 (ST-14), die als kleinste notwendige Struktur, um die Bildung spezifischer Antikörper auszulösen, identifiziert wurde, ausgewählt. Diese synthetischen CPS Fragment-Derivate wurden an das Carrier-Protein CRM197 gebunden, um Impfstoff-Kandidaten zu enthalten. Die immunologische Testung dieser neuartigen Glycokonjugate wurde in Mäusen durchgeführt. Abbildung 1: Schematische Struktur der (A) natürlichen Kapselpolysaccharide und (B) der über Spacer verknüpfte RUs. Neben CPSs gehören auch TAs zu den interessanten Zielstrukturen, die genutzt werden können, um von Gram-positiven Bakterien verursachte Krankheiten zu bekämpfen. Die in Wandteichonsäuren (WTAs) am häufigsten vorkommenden sich wiederholden Einheiten bestehen aus Glycerinphosphat (GroP) und Ribitphosphat (RboP). Die Hydroxygruppen von GroP und RboP sind in den meisten Fällen mit kationischen D-Alaninestern und Monosacchariden, häufig Glucose oder N-Acetylglucosamin, bestückt. Besonders die RboP Einheiten in Staphylococcus aureus enthalten fast alle O-GlcNAc. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde ein WTA-Fragment, ein Trimer von RboP, synthetisiert, um die Funktion der WTAs genauer zu erforschen und um die Biosynthese zu entschlüsseln. Durch Soaking wurden Protein-Liganden-Kristalle von dem synthetisierten Fragment und TarP-Glycosyltransferase, welche in S. aureus RboP mit O-GlcNAc modifiziert, erhalten, wodurch die Bindungsdomäne des Proteins charakterisiert werden konnte (Abbildung 2). Darüber hinaus konnten durch zielgerichtete Mutagenese-Experimente mit TarP die für die enzymatische Aktivität entscheidenden Aminosäuren identifiziert werden. Abbildung 2: Interaktion der Aminosäurereste im aktiven Zentrum von TarP mit dem synthetischen RboP-Trimer. OMIT Map des synthetischen RboP-Trimers (Konturlevel: 3 σ) ist verzeichnet (Inset). Eine Grundvoraussetzung, um die Rolle von Glycanen in biologischen Prozessen weiter erforschen zu können und damit pathogenen Bakterien etwas entgegen setzen zu können, ist Zugang zu definierten Oligosacchariden in größeren Mengen. Auch wenn auf dem Gebiet der Kohlenhydratchemie in der Vergangenheit viele Erfolge erzielt wurden, sind die genauen Mechanismen, wie Glycosylierungen beeinflusst werden können, nicht vollständig geklärt. So können Reaktionsbedingungen, die für ein Substrat optimiert wurden, nicht generell auf andere übertragen werden, wie das in der Peptid- und Oligonucleotid-Synthese der Fall ist. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Ansätze verfolgt, um Einsicht in den Glycosylierungs-Prozess zu gewinnen. In Kapitel 4 wird gezeigt, dass das kostengünstige 1,3-Dibrom-5,5-dimethylhydantoin (DBDMH) sowohl in der Flüssigphasensynthese als auch in der automatisierten Festphasensynthese erfolgreich als leitungsstarker Promoter für die Aktivierung von Thioglycosiden eingesetzt werden kann (Abbildung 3). Verschiedene Glycosylbausteine, die mit unterschiedlichen Schutzgruppen ausgestattet wurden, zeigten bei Aktivierung mit DBDMH vielversprechende Ergebnisse, während die Stereoselektivität der Reaktionen den in der Literatur bekannten Tendenzen entsprach. Verglichen mit N-Iodsuccinimid (NIS), das häufig zur Aktivierung von Thioglycosiden eingesetzt wird, ist dieser Promoter leicht zugänglich, sehr gut löslich und auch bei Raumtemperatur stabil in Lösung. Abbildung 3: 1,3-Dibrom-5,5-dimethylhydantoin (DBDMH) als Promoter für Thioglycoside. In ähnlicher Weise gibt Kapitel 5 weitere Einsichten in den Mechanismus, der Glycosylierungen zugrunde liegt, indem mittels Kaltionen-Spektroskopie IR- Spektren von Glycosylkationen aufgezeichnet wurden. Es wird generell angenommen, dass bei diesen Reaktionen intermediär Oxocarbenium-Ionen entstehen, dies konnte bis jetzt allerdings nicht nachgewiesen werden. Um die Existenz dieser Kationen empirisch zu beweisen, wurde ein Satz an Monosacchariden, die alle unterschiedliche Schutzgruppen tragen, synthetisiert und in Glycosylkationen überführt und diese dann mittels Kaltionen- Spektroskopie charakterisiert. Kann auf diese Weise der Prozess der Glycosylierungsreaktion auf molekularer Ebene aufgeklärt werden, könnte dies die Entwicklung einer universalen Methode ermöglichen und so Kohlenhydratchemie in Zukunft deutlich erleichtern.