Die Isozyme der Proteinkinase-C-Familie sind Schlüsselmoleküle in der Signaltransduktion. Die klassische Isoform Proteinkinase Cα (PKCα) kann in den Zellkern translozieren und wahrscheinlich Einflüsse auf die Genexpression ausüben. Daher ist die Identifikation ihres Kernlokalisationssignals, ihrer Interaktionspartner und Substrate von besonderem Interesse.
Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde der Versuch unternommen, das in vorausgegangenen Arbeiten unseres Labors auf einen Teil der regulatorischen Domäne der PKCα eingegrenzte Kernlokalisationssignal (Wagner 1999) genauer zu definieren. Dazu wurden Zellen mit Expressionsvektoren transfiziert, die PKCα- Deletionsmutanten codierten, die mit GFP-β Galaktosidase bzw. mit zwei GFP- Molekülen fusioniert waren. Die erzielten Ergebnisse erlauben keine Aussage bezüglich der Präsenz eines NLS innerhalb der C1-Domäne der PKC, da die Fusionsproteine überraschenderweise eine ausgesprochen hohe Cytotoxizität aufweisen und in Aggregaten variabler Gestalt und Größe assemblieren.
Offensichtlich können also in diesem Fall GFP-Konstrukte nicht zur Klärung der oben genannten Fragestellung verwendet werden.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde auf der Grundlage von Vorarbeiten unseres Labors (Rosenberger 1997) nachgewiesen, daß der PTB-assoziierte Spleißfaktor (PSF) ein Bindungs-partner für PKCα ist. Dabei handelt es sich um das erste nucleäre PKC-bindende Protein überhaupt. Die Bindung ist abhängig von der Aktivierung der PKCα. Desweiteren wurde festgestellt, daß PSF ein schwaches Substrat der PKCα ist.
Bei der Suche nach weiteren Substraten der PKCα wurden in vitro- Phosphorylierungen von Kermembranen bzw. deren Triton X-100 resistenten Fraktionen durchgeführt und die Proteine anschließend mittels zweidimensionaler BAC-SDS-PAGE aufgetrennt. In der Auto-radiographie sichtbare Spots konnten aus den Gelen ausgestochen und mittels MALDI-TOF- Massenspektrometrie konnten 12 neue Substrate der PKCα zusätzlich zu dem bereits erwähnten PSF identifiziert werden. Darunter sind unter anderem mit dem Heterochromatin 2, dem Ott-Protein und einem putativen Protein drei neue Proteine identifiziert worden, die bislang nur aufgrund genetischer Daten in den Datenbanken zu finden waren und über deren Funktion demzufolge bislang nichts bekannt ist.
Die biologischen Funktionen, die die anderen Proteine erfüllen, sind ebenso wie mögliche Bedeutungen ihrer Modifikation durch PKCα vielfältig. Sie erfüllen u.a. Aufgaben bei so wichtigen Prozessen wie Spleißen, beim mRNA- Export, bei der Chromatinorganisation, bei der Genregulation und bei der Ribosomenbiogenese.
The family of protein kinase C (PKC) isozymes are key-players in many signaltransduction pathways. The classical isoform PKCα is able to translocate into the nucleus and probably to induce changes in gene expression. Therefore identification of its nuclear localization signal, interacting proteins and its substrates in the nucleus are of special interest.
Based on earlier work in our laboratory which led to prediction of a nuclear localization signal NLS in the C1-region of PKCα (Wagner, 1999), fusion proteins of deletion mutants of PKCα and either GFP-β-Galactosidase or two GFP-molecules, respectively, were constructed and expressed in mammalian cell lines by transient expression to exactly define the NLS of PKC&alpha.; The localisation pattern of the fusion proteins were analysed by confocal laser scan-ning microscopy. Surprisingly, the fusion proteins turned out to be cytotoxic, assembling in multiple intracellular aggregates with different shape and sizes. Based on these observations it was concluded that the approach of expressing fusion proteins cannot be used to find the exact NLS of PKCα.
The second part of this work was aimed to identify interacting partners and substrates of nuclear PKCα. Nuclear extracts of mammalian cells were incubated with GST-PKCα, immuno-precipitated and subsequently analysed with western blot analysis, which reveals that PTB associated splicing factor (PSF) is a PKCα- interacting protein. This interaction depends on the activation status of PKCα. It was also shown that PSF is a weak substrate of PKCα.
In search for additional substrates of PKCα nuclear membranes and their detergent insoluble fractions where phosphorylated in vitro. The proteins were separated via 2D BAC-SDS-PAGE and gel spots corresponding to the autoradiography were used to identify the proteins by MALDI-mass spectrometry. With this method, we identified substrates, which are already known in literature as well as 13 new substrates of PKC&alpha.; Three of these proteins (heterochromatin 2, the Ott-protein and a putative protein) are known only from sequence data. The other newly identified substrates of PKCα, which include PSF, are known to be involved in many different processes including splicing, the export of mRNA, chromatin organization, regulation of gene- expression and biogenesis of ribosomes.
