Die Experimente der vorliegenden Arbeit zur Untersuchung von Mikrotubuli und Mikrofilamenten an primären Mäuseneuronen geben hinsichtlich der untersuchten Zellart und Tau-Epitope sowie der Untersuchungszeiträume einen neuen Einblick in die Effekte nach spezifischer Hemmung von GGT, ROCK und Rac1 und untersuchen mögliche Zusammenhänge einer Hyperphosphorylierung von Tau. Während Rac1 und GGT essentiell für das neuronale Überleben waren, hatte die Inhibition von ROCK keinen Effekt darauf. Bei den immunohistochemischen Experimenten der neuronalen Zellkulturen wurden nach Rac1-Inhibition zunächst kleinere Wachstumskegel beobachtet, später massive Schäden am Zytoskelett, wie z.B. die Fragmentierung der Zellfortsätze, Schäden an den Phalloidin-positiven F-Aktinstrukturen bis hin zur vollständigen Zerstörung von Zellen. Die Untersuchungen nach Hemmung von GGT zeigten die gleichen Effekte wie nach Rac1-Inhibition, wobei die beobachteten Effekte erst nach einer etwa 2h längeren Inkubationszeit im Vergleich zur Rac1-Inhibition auftraten. Die ROCK- Inhibition führte zu keinen Schäden sondern bewirkte besser entwickelte Mikrofilamente insbesondere im Bereich der Wachstumskegel. Anschließend wurde untersucht, inwieweit die spezifische Inhibition von GGT, ROCK und Rac1 zu einer Hyperphosphorylierung von Tau führt. In einer vorherigen Publikation der Arbeitsgruppe an primären Rattenneuronen wurde gezeigt, dass die Inkubation mit Lovastatin und die Inhibition von GGT zu einem transienten Anstieg der Phosphorylierung an bestimmten Tauepitopen von Rattenneuronen führten. Ziel der Experimente war es zu prüfen, ob ein Zusammenhang zwischen den bekannten konzentrations- und zeitabhängigen Schädigungen von neuronalen Zellkulturen nach Statinbehandlung sowie GGT, ROCK und Rac1-Inhibition besteht. Dazu wurde untersucht, ob es nach Inhibition von GGT, ROCK und Rac1 zu einer erhöhten Tau-Phosphorylierung kommt wie beispielsweise bei der Alzheimerschen Krankheit. Die Untersuchungen zur Phosphorylierung der Tauepitope Ser262, Ser202 Thr205 und Ser396 Ser404 zeigten nach Inhibition von ROCK, GGT und Rac1 und der Westernblotanalyse keine erhöhte Phosphorylierung innerhalb des untersuchten Zeitraums von 24h. Die Phosphorylierung von Tau scheint, mit Ausnahme einer Phosphorylierungsabnahme bei der Tau-Fragmentierung, nicht an den hier untersuchten Epitopen durch Inhibition von ROCK, GGT und Rac1 in primären Mäuseneuronen beeinflusst zu werden.
Our experiments on microtubules and microfilaments on primary mice neurons reveal new aspects regarding the cell type, tau epitopes and the duration of inhibition of GGT, ROCK and Rac1 and analyze a potential connection between that inhibition and tau hyperphosphorylation. We showed that Rac1 and GGT are essential to neuronal survival, whereas the inhibition of ROCK had no such effect. In our immunohistochemical experiments Rac1 inhibition resulted in a reduced size of growth cones and eventually in damages of the cytoskeleton, e.g. fragmentation of dendrites and axons and damages of the phalloidin- positive f-actin structures up to the total destruction of the cells. The effects of GGT inhibition were similar to the ones with the Rac1 inhibitor except from a longer incubation period of approximately two hours of treatment. The ROCK inhibition had a slightly positive effect on the development of microfilaments in the growth cones. In addition, we examined the connection between a specific inhibition of GGT, ROCK and Rac1 and the hyperphosphorylation of tau. In previous studies of this group on primary rat neurons there was evidence that incubation with Lovastatin and inhibition of GGT led to transient higher phosphorylation of some of the tau epitopes. Consequently, the focus of our analyses was the connection between the well- known damages on neuronal cell cultures after statin incubation and a specific inhibition of GGT, ROCK and Rac1. Hence, we analyzed if the inhibition of GGT, ROCK and Rac1 leads to a higher phosphorylation of tau as observed in the Alzheimer’s disease. Therefore, we selected to examine the tau epitopes ser262, ser202 thr205 und ser396 ser404 and incubated primary mice neurons with the inhibitor of GGT, ROCK and Rac1 for up to 24 hours and run a western blot analysis. We could not find any effect on the phosphorylation of the tau epitopes in primary mice neurons except from a reduced phosphorylation of the tau fragmentation.
