Charakterisierung von Ceramidase-Inhibitoren an der humanen Keratinozyten- Zellinie HaCaT

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden die Phenylaminoalkohol-Derivate D-erythro-2-(N-Myristoylamino)-1-phenyl-1-propanol (D-e-MAPP), L-erythro-2-(N-Myristoylamino)-1-phenyl-1-propanol (L-e-MAPP) und das neu synthetisierte Analogon D-threo-2-(N-Myristoylamino)-1-(4-nitrophenyl)-1,3-propandiol (D-NMAPPD bzw. B13) im Hinblick auf ihre biologischen und biochemischen Wirkungen in HaCaT- Keratinozyten untersucht. Kuerzlichen Veroeffentlichungen zufolge fuehrte D-e-MAPP in HL-60 Zellen durch Inhibition der alkalischen Ceramidase zu intrazellulaerem Ceramid-Anstieg und nachfolgender Zellwachstumshemmung. Wir hingegen konnten fuer HaCaT-Keratinozyten zeigen, dass D-e-MAPP und B13 die saure Ceramidase inhibieren, wobei B13 den staerksten Inhibitor darstellt und L-e-MAPP keinen signifikanten Effekt hat. Die alkalische Ceramidase wurde durch keines der drei Derivate beeinflusst. Es konnte ein Anstieg des intrazellulaeren Ceramid-Gehalts in direkter Proportionalitaet zum Grad der Ceramidase-Inhibition gemessen werden, gefolgt durch zeit- und konzentrationsabhaengige Apoptose und Proliferationshemmung der Zellen, wie dies auch fuer die Behandlung mit exogen gegebenen Ceramiden beschrieben wurde. Die Apoptose-Induktion durch B13 konnte durch Bcl-2-Ueberexpression der Zellen nahezu vollstaendig antagonisiert werden, implizierend, dass das durch saure Ceramidase-Inhibition generierte Ceramid seine Wirkung ueber mitochondriale Cytochrom c-Freisetzung mit nachfolgender Caspasen-Aktivierung und Apoptose enfaltet. Apoptose-Induktion und Proliferationshemmung waren, aehnlich den biochemischen Effekten, bei B13 am staerksten zu verzeichnen. Eine gewisse Stereospezifitaet -nur die D-Stereoisomere, nicht das L-Stereoisomer fuehrte zu den beobachteten Effekten- koennte neben anderen strukturellen Besonderheiten (1-Hydroxyl-Gruppe von B13 an einer dem Ceramid gleichen Position) wichtig fuer die Substraterkennung bzw. Bindungsfaehigkeit der Ceramidase sein und somit die biologische Funktionalitaet beeinflussen. Wir konnten in HaCaT-Keratinozyten demonstrieren, dass sich der endogene Ceramid-Spiegel durch Beeinflussung der sauren Ceramidase modulieren laesst und von wichtigen biologischen Konsequenzen begleitet wird. Dies hebt die saure Ceramidase neben ihrer Funktion des lysosomalen Abbaus von Sphingolipiden als eines der Schluessel-Enzyme des Ceramid-Stoffwechsels und somit zellulaerer Signaltransduktionsmechanismen hervor. Die untersuchten Ceramidase-Inhibitoren koennten eine neue Substanzklasse fuer die Therapie von sowohl benignen hyperproliferativen Hautkrankheiten, wie der Psoriasis vulgaris, als auch von malignen Hautkrankheiten, z.B. des Basalzell- oder Plattenepithelkarzinoms darstellen.

In the present dissertation the biological effects of phenylaminoalcohol analogues D-erythro-2-(N-myristoylamino)-1-phenyl-1-propanol (D-e-MAPP), L-erythro-2-(N-myristoylamino)-1-phenyl-1-propanol (L-e-MAPP) and the newly synthesized analogue D-threo-2-(N-myristoylamino)-1-(4-nitrophenyl)-1,3-propandiol (D-NMAPPD or B13) were studied in HaCaT keratinocytes. In recent publications D-e-MAPP was shown to inhibit the alkaline ceramidase leading to increased level of intracellular ceramide and inhibition of cell growth in HL-60 cells. In contrast, we could demonstrate in HaCaT keratinocytes that D-e-MAPP and B13 inhibit the acid ceramidase activity whereas B13 was the most potent inhibitor. All three derivatives did not influence the activity of the alkaline ceramidase. L-e-MAPP on the other hand was an inactive analogue. Ceramidase inhibition was followed by time and concentration dependent increase of intracellular ceramide level with subsequent increase of apoptosis and suppression of proliferation of HaCaT keratinocytes. B13 was again more potent in inducing apoptosis and inhibiting cell growth. Bcl-2 overexpression abolished apoptosis triggered by B13 indicating that the generated ceramide leads to apoptosis via mitochondrial cytochrome c-release and following caspase activation. In addition to stereospecificity -only D-stereoisomers were active- other structural features might be important for substrate recognition and binding of ceramidase and thereby affecting its biological function. We could demonstrate in HaCaT keratinocytes that the endogenous ceramide level can be modulated by influencing the acid ceramidase activity followed by ceramide-specific biological responses. These findings show that acid ceramidase is not only involved in lysosomal degradation of sphingolipids as previously described but is a key enzyme in ceramide metabolism and cellular signal transduction. The investigated ceramidase inhibitors might represent a new class of drugs in the therapy of benign hyperproliferative skin diseases such as psoriasis vulgaris as well as in malignant skin diseases.