The tethered toxin (t-toxin) strategy for the recombinant expression of membrane-bound snake and snail toxins was developed based on the structure of mammalian prototoxins. It successfully has been used to modulate voltage-gated sodium and calcium channels in mice. The work here expands its usefulness to ligand-gated ion channels. It is shown that the tethered form of the conotoxin GID (tGID) completely blocks acetylcholine-induced α7 nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) currents in vitro. Furthermore, for the first time the transgenic expression of tGID in mice is demonstrated. Hereby the expression is successfully restricted to one cochlear cell type (spiral ganglion neurons, SGNs). SGN nAChRs are thought to be involved in lateral olivocochlear (LOC) signalling. The assumed blocking of α7 nAChRs by tGID has no influence on the LOC system, though. However, this is not due to the t-toxin approach as recent data suggest that not the targeted nAChRs but rather muscarinic receptors are involved in LOC signalling. TRP channels are important for mechanosensation in several animal models and physiological systems. This work presents data from reporter mice that suggest a function for Trpp2 and Pc-1 proteins in the auditory system. In particular it is shown that Trpp2 is expressed specifically from birth until hearing onset by few neurons in the cochlear nucleus and by the majority of SGNs. Few SGNs presumably remain Trpp2-positive even beyond hearing onset and are tentatively classified as type III SGNs. The presence of a third SGN subtype is also suggested by additional (immuno)histological findings at P24. For the first time this study describes a TRPP2-dependent phenotype in mammals outside the kidney. The accomplished neuron-specific knockout of Trpp2 results in reduced levels of Trpp2 in SGNs and a complete absence of Trpp2 in the brainstem. This leads to a change of the amplitude of the compound action potential in auditory brainstem response recordings. It is hypothesised that the loss of Trpp2 in SGNs or cochlear nucleus cells influences the globular (bushy) cell pathway in a way that overall network activity in the lower auditory brainstem is increased. Lastly, this report characterises transgenic mouse lines that specifically express the fusion protein EGFP_L10a in different inner ear cell types. Following the TRAP methodology these BAC-transgenic mice have been shown to be valuable tools for the identification of yet unknown proteins. Notably, VGLUT3-EGFP_L10a and SNAP25-EGFP_L10a mice will be useful for ribosome profiling of hair cells and spiral ganglion neurons, respectively. Ultimately, these mice could help to identify low-level transcripts of proteins that are part of the mechano- electrical transducer (MET) apparatus. In conclusion this work presents evidence for the general applicability of two novel genetic methodologies in the inner ear (t-toxins, TRAP). Using a well-established method (Cre-loxP- system) it could additionally be shown that the ion channel TRPP2 fulfils a substantial role in auditory processing.
Basierend auf der Struktur von in Säugetieren nachgewiesenen Prototoxinen wurde eine Methode zur rekombinanten Expression von membrangebundenen Schnecken- und Schlangentoxinen entwickelt: die Methode der angehefteten Toxine (tethered toxins). Diese Technologie wurde bereits erfolgreich zur Regulierung von spannungsabhängigen Natrium- und Kalziumkanälen in Mäusen angewandt. Die vorliegende Arbeit erweitert den Anwendungsbereich auf ligandenabhängige Ionenkanäle. Es wird gezeigt, dass das angeheftete Konotoxin GID (tGID) den nikotinischen Azetylcholinrezeptor α7 in vitro vollständig inhibiert. Darüber hinaus konnte zum ersten Mal die transgene Expression von tGID in Mäusen gezeigt werden. Die Expression wurde hierbei erfolgreich auf einen einzigen Zelltyp der Cochlea, das Spiralganglienneuron (SGN), beschränkt. Die nAChR der SGN werden mit dem lateralen olivocochleären (LOC) Signalweg in Verbindung gebracht. Allerdings hat die angenommene Inhibierung der α7 Rezeptoren durch tGID keinen messbaren Einfluss auf den LOC Signalweg. Dies ist jedoch nicht auf die Methode der angehefteten Toxine zurückzuführen. Vielmehr wurde kürzlich gezeigt, dass muskarinische – und nicht die in dieser Studie anvisierten nikotinischen – Rezeptoren an der cholinergen Erregungsübertragung des LOC Signalweges beteiligt sind. TRP Ionenkanäle sind wichtig für Sinnesempfindungen, die durch mechanische Reize hervorgerufen werden. Die mithilfe von Reportermauslinien erlangten Ergebnisse dieser Arbeit weisen auf eine Beteiligung von Trpp2 und Pc-1 an Prozessen im Hörsystem hin. Insbesondere wird gezeigt, dass Trpp2 von der Geburt bis zum Hörbeginn von einigen Cochleariskernneuronen und der Mehrzahl der SGN exprimiert wird. Einige SGN bleiben vermutlich darüber hinaus Trpp2-positiv und werden vorläufig als SGN des Typs III klassifiziert. Die Existenz eines dritten Subtyps von SGN wird durch weitere, an P24 Mäusen gewonnene (immun)histologische Erkenntnisse dieser Untersuchung gestützt. Darüber hinaus wird in dieser Arbeit zum ersten Mal ein TRPP2-abhängiger Phänotyp in Säugetieren beschrieben, der nicht mit Nierenfunktionen assoziiert ist. Das spezifische Ausschalten von Trpp2 in Neuronen der Maus führt zu einer Verringerung von Trpp2-Transkripten in der Cochlea und zu einem vollständigen Verlust dieser im Hirnstamm. Audiometriemessungen zeigen eine Amplitudenänderung des summierten Aktionspotenzials. Dieses Ergebnis stützt die Annahme, dass in den getesteten Mäusen der Verlust von funktionalem Trpp2 in SGN oder den Cochleariskernen den Signalweg der runden Krauszellen derart beeinflusst, dass die gesamte Netzwerkaktivität des auditorischen Hirnstamms erhöht wird. Schließlich wurden im Rahmen dieser Studie transgene Mauslinien charakterisiert, die das Fusionsprotein EGFP_L10a in verschiedenen Zelltypen des Innenohres exprimieren. Diese Linien bilden die Voraussetzung für die Anwendung der TRAP-Technologie zur Bestimmung unbekannter Proteine. Es wurde dargelegt, dass insbesondere die Linien VGLUT3-EGFP_L10a und SNAP25-EGFP_L10a für die Ermittlung des Translatoms von Haarzellen beziehungsweise SGN wertvoll werden könnten. Letztendlich wird dies auch die Identifizierung von seltenen Proteintranskripten des mechanoelektrischen Signalumwandlerkomplexes (MET) voranbringen. Die Ergebnisse dieser Arbeit belegen die allgemeine Eignung zweier neuer, biotechnologischer Methoden (angeheftete Toxine, TRAP) zu weitergehenden Untersuchungen von Innenohrprozessen. Mit Hilfe der konditionellen Transgenese konnte zusätzlich gezeigt werden, dass der Ionenkanal TRPP2 eine wesentliche Aufgabe bei der Verarbeitung auditorischer Reize erfüllt.
