Xpo1 ist das Ortholog des Kerntransport-Rezeptors Crm1 in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae. In höheren Eukaryoten exportiert Crm1 Proteine wie den Transkriptions-Faktor AP-1 und den Tumor-Suppressor p53 aus dem Zellkern ins Zytoplasma. Eine Rolle von Crm1 im Export von messenger-RNA wird gegenwärtig kontrovers diskutiert. Dagegen ist Xpo1 in der Bäckerhefe sowohl am Protein- wie auch am mRNA-Export beteiligt. Trotz der essentiellen Funktion von Xpo1 konnten erst wenige Transport-Substrate identifiziert werden. Xpo1 bindet im Kern kooperativ an Frachtmoleküle, die eine Kernexportsequenz (nuclear export sequence, NES) besitzen, und an die GTPase Ran/Gsp1, die im Kern in GTP-beladener Form vorliegt. Nach der Passage durch die Kernpore lösen im Zytoplasma lokalisierte Faktoren die Hydrolyse von Ran-GTP zu Ran-GDP aus. Dies bewirkt eine Konformationsänderung und führt zur Freisetzung des Frachtmoleküls. Unbeladenes Xpo1 kehrt in den Kern zurück. Kerntransport- Rezeptoren und Ran spielen auch eine Rolle in der Bildung einer bipolaren Spindel: in höheren Eukaryoten ist Crm1 an der Kontrolle der Centrosomen- Verdopplung beteiligt, und die Lokalisation von Ran-GTP an den Chromosomen fördert die Bildung der Kernspindel. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst versucht, die Bedeutung der verschiedenen Domänen von Xpo1 im Protein- und mRNA-Export zu klären. Dazu wurden mehrere Mutationen in XPO1 eingefügt. Die entstandenen xpo1-Allele verursachten unterschiedlich starke Defekte im Protein- und mRNA-Export. Ein eindeutiger Zusammenhang zwischen den beobachteten Defekten und den Änderungen in der Proteinsequenz war jedoch nicht festzustellen. Zur Identifikation neuer Interaktionspartner von Xpo1 wurde eine ungerichtete 2-Hybrid-Analyse durchgeführt, in der u.a. das Spindelpolkörper-Protein Spc72 gefunden wurde. Der Spindelpolkörper ist das funktionelle Äquivalent der Centrosomen höherer Eukaryoten. Spc72 verankert an der zytoplasmatischen Seite den γ-Tubulin-Komplex, von dem die Mikrotubuli polymerisieren. In Analogie zur Bindung von Crm1 an die Centrosomen wurde auch in der Bäckerhefe eine Lokalisation von Xpo1 an den Spindelpolkörpern nachgewiesen. Sie kann durch Änderung des Ran-Staus der Zelle beeinflusst werden. Sie ist jedoch nicht nur von Spc72 abhängig, da sich auch in einem SPC72-Deletionsstamm Xpo1 an den Spindelpolkörpern befindet. Durch in vitro- Bindungsstudien konnte gezeigt werden, dass Xpo1, Spc72 und Ran-GTP einen trimeren Komplex bilden, der die Kriterien eines Export-Komplexes erfüllt. Eine NES in Spc72 wurde identifiziert und ihre Funktion in einer 2-Hybrid- Analyse und in Reporter-Plasmid-Analysen bestätigt. Die Mutation der NES von Spc72 führt in der Zelle zu einer Verringerung der Spc72-Menge an den Spindelpolkörpern. Dies verursacht eine Reduktion der zytoplasmatischen Mikrotubuli. Dieser Phänotyp wurde auch in xpo1-Allelen gefunden. Damit konnten erste Hinweise auf eine funktionelle Wechselwirkung zwischen Xpo1 und Spc72, die von der NES in Spc72 abhängt, geliefert werden. Darüber hinaus zeigt diese Arbeit zum ersten Mal eine Lokalisation von Xpo1 am Spindelpolkörper in der Bäckerhefe. Xpo1 könnte an Prozessen wie der Spindelpolkörper-Verdopplung, der Regulation der Mikrotubuli-Polymerisation oder der Verteilung des γ-Tubulin-Komplexes beteiligt sein.
Xpo1 is the orthologue of the nuclear transport receptor Crm1 in the budding yeast Sac-charomyces cerevisiae. In higher eukaryotes, Crm1 exports proteins such as the transcription factor AP-1 or the tumor suppressor p53 from the nucleus to the cytoplasm. A role of Crm1 in messenger RNA export is discussed contoversely. In contrast, Xpo1 is involved in protein and mRNA export in the budding yeast. Despite Xpo1's essential function, only few transport substrates have been identified so far. Xpo1 binds in the nucleus cooperatively to cargo molecules containing a nuclear export sequence (NES) and to the GTPase Ran/Gsp1, which exists in the nucleus in its GTP-bound form. After passage through the nuclear pore, factors localized in the cytoplasm trigger the hydrolysis of Ran-GTP to Ran-GDP. This causes a conformational change which leads to cargo release. Unloaded Xpo1 travels back into the nucleus. Nuclear transport receptors and Ran also play a role in the formation of a bipolar spindle: in higher eukaryotes, Crm1 is involved in the control of centrosome duplication, and the localization of Ran-GTP at the chromosomes promotes the formation of the nuclear spindle. In the present work, at first the importance of the different Xpo1 domains in protein and mRNA export was analyzed by introducing several mutations in the XPO1 coding region. The resulting xpo1 alleles showed various defects in protein and mRNA export, but a clear correlation between the observed defects and the alterations in the protein se-quence was not obvious. To identify new proteins interacting with Xpo1, an undirected 2-hybrid assay was performed. Among other proteins Spc72 was found, a component of the spindle pole body, the functional equivalent of the centrosomes in the budding yeast. Spc72 anchors the γ-tubulin complex from which microtubules polymerize at the cytosolic face of the spindle pole body. By analogy of Crm1 binding to centrosomes in mammalian cells, the localization of Xpo1 was determined. Also in the budding yeast, Xpo1 can be found at the spindle pole bodies, and this localization can be affected by changing the Ran status of the cell. However, Xpo1's localization is not solely dependent on Spc72 as it still binds to the spindle pole bodies in a SPC72 deletion strain. The interaction of Xpo1 with Spc72 was analyzed further by in vitro binding assays. Xpo1, Spc72, and Ran-GTP form a trimeric complex that fulfills the criteria of a nuclear export complex. A NES could be identified in Spc72 and its function was confirmed by a 2-hybrid assay and reporter plasmid assays. Mutations in this NES decrease the amount of Spc72 at the spindle pole bodies in the cell and cause a reduction of cytoplasmic microtubules. This phenotype was also observed in Xpo1 alleles. This work shows first hints to a functional interaction between Xpo1 and Spc72 in the cell that is dependent on the NES of Spc72. Moreover, a localization of Xpo1 at the spindle pole bodies in the budding yeast was proved for the first time. Xpo1 could participate in processes such as spindle pole body duplication, regulation of microtubule polymerisation or distribution of the γ-tubulin complex.
