Circadian clocks are endogenous oscillations that drive 24-hour rhythms of physiology and behavior. Circadian rhythms exist in nearly all cells of the body with a gene-regulatory network as fundamental clockwork. These molecular clocks not only drive the rhythmic transcription of about ten percent of all genes but also seem to regulate rhythmic protein abundances by mechanisms beyond transcriptional control. Indeed, up to twenty percent of the mammalian proteome are circadian. The extent of post-transcriptional processes controlling circadian protein abundance, however, is hardly studied so far. Here, the contribution of timed degradation for the regulation of circadian protein rhythms is investigated. To this end, a human protein library was analyzed using a fluorescence based reporter system that measures alterations in protein abundance as readout of altered protein stability. In order to determine time-of-day dependent protein stability, the cellular clock was ’clamped’ at a specific circadian phase by the ectopic overexpression of CRY1, a strong negative inhibitor of molecular clock dynamics. Applying the fluorescence based method in cells with a ’clamped’ clock in comparison to unsynchronized cells enabled to perform a proteome-wide analysis of circadian stability. Revealed screen results represent a snapshot of the circadian proteome ’clamped’ at a phase of increased CRY1 level. About nine percent of analyzed proteins were identified as CAAPs (CRY1 mediated altered abundant proteins), representing proteins with potential circadian abundance as result of timed degradation. Indeed, rhythmically abundant proteins are enriched among CAAPs. Furthermore, in accordance with circadian proteome studies, CAAPs are overrepresented in processes related to vesicular trafficking and mitosis. Interestingly, CAAPs are underrepresented among modifiers of circadian dynamics. This postulates a role of circadian protein stability for the rhythmic fine-tuning of clock output functions rather than for regulatory mechanisms of molecular core clock dynamics. Together, the results of this study indicate first of all, an unexpected role of rhythmic protein degradation for the control of the circadian proteome, and secondly, suggest that rhythmic protein stability is essential as a timing signal for circadian clock output processes.
Circadiane Uhren sind endogen getriebene Oszillationen, welche 24-Stunden Rhythmen der Physiologie und des Verhaltens steuern. Circadiane Rhythmen existieren in nahezu allen Zellen des Körpers und basieren auf einem genregulatorischen ’Uhrwerk’. Diese molekularen Uhren steuern die rhythmische Transkription von etwa zehn Prozent aller Gene. Darüber hinaus regulieren molekulare Uhren Proteinrhythmen, vermutlich durch zusätzliche Mechanismen neben der transkriptionellen Kontrolle. In der Tat liegen bis zu zwanzig Prozent des Säugetierproteoms circadian abundant vor. In welchem Umfang circadiane Proteinrhythmen durch post-transkriptionelle Prozesse kontrolliert werden, ist jedoch bisher wenig untersucht. In dieser Studie wurde der Beitrag des tageszeitspezifischen Abbaus zur Regulation circadianer Proteinrhythmen untersucht. Dazu wurde eine humane Proteinbibliothek unter Anwendung eines fluoreszenzbasierten Reportersystems untersucht. Das Reportersystem misst Unterschiede in der Proteinmenge als Kennzeichen verschiedener Proteinstabilitäten. Um tageszeitabhängige Proteinstabilität bestimmen zu können, wurde die zellulare Uhr in einer spezifischen Phase ’arretiert’. Dies erfolgte durch die ektopische Überexpression von CRY1, einem stark negativen Inhibitor der molekularen Uhr-Dynamik. Unter Anwendung der fluoreszenzbasierten Methode in Uhr-’arretierten’ Zellen im Vergleich zu unsynchronisierten Zellen, konnten circadiane Stabilitäten proteomweit analysiert werden. Die Ergebnisse der Untersuchung repräsentieren eine Momentaufnahme des circadianen Proteoms, ’arretiert’ in einer Phase erhöhter CRY1 Proteinmengen. Etwa neun Prozent aller untersuchten Proteine wurden als CAAPs (CRY1 mediated altered abundant proteins; deutsch: Proteine mit CRY1 induzierter, veränderter Abundanz) identifiziert. Diese stellen eine Gruppe von Proteinen mit vermutlich circadianer Abundanz als Ergebnis des tageszeitspezifischen Abbaus, dar. In der Tat sind rhythmisch abundante Proteine unter den CAAPs angereichert. In Übereinstimmung mit circadianen Proteomstudien, sind CAAPs in Prozessen des vesikulären Transports und der Mitose überrepräsentiert. Interessanterweise sind CAAPs unter molekularen Komponenten, welche die circadiane Uhr beeinflussen, unterrepräsentiert. Das deutet auf eine Funktion der circadianen Proteinstabilität in der rhythmischen Feinabstimmung Uhr-getriebener Prozesse hin, welche die molekulare Uhr selbst, nicht regulieren. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse dieser Studie dem rhythmischen Proteinabbau eine unerwartete Rolle in der Regulation des circadianen Proteoms zu und deuten des Weiteren daraufhin, dass rhythmische Proteinstabilität als Übermittler von Zeitinformationen in Uhr-gesteuerten Prozessen essenziell ist.