Redox-sensing mechanisms under hypochlorite stress in Staphylococcus aureus

Abstract

Glutathione (GSH) is the major low molecular weight (LMW) thiol of eukaryotic organisms and Gram-negative bacteria to maintain the redox balance (chapters 1-2). However, Gram-positive bacteria do not produce GSH. Bacillithiol (BSH) is utilized as alternative LMW thiol in Firmicutes, such as Bacillus subtilis and Staphyloccoccus aureus. Mycothiol functions instead as major LMW thiol in all Actinomycetes, such as Mycobacteria and Corynebacteria. Under oxidative stress, LMW thiols form mixed disulfides with proteins thiols, termed as S-thiolations which function as thiol-protection and redox-control mechanism. The main goal of this work was the identification of novel thiol-switches and S-thiolated proteins in the thiol-redox proteome of the human pathogens S. aureus and Corynebacterium diphtheriae under hypochlorous acid (HOCl) stress. HOCl is a highly reactive oxidant that is produced during neutrophil infections and is the major cause of bacterial killing. Using the thiol-redox proteomics approach OxICAT, 58 NaOCl-sensitive protein thiols with >10% increased oxidations could be identified in S. aureus USA300 (chapters 3 4). Among these are five S-bacillithiolated proteins, including the two aldehyde dehydrogenases GapDH and AldA which showed the highest oxidation increase of ~29 % in the OxICAT analysis. GapDH and AldA were S-bacillithiolated at their active site Cys residues, Cys151 in GapDH and Cys279 in AldA. GapDH represents the most abundant S-bacillithiolated protein contributing with 4% to the total Cys proteome of S. aureus. The catalytic active sites of GapDH and AldA are very sensitive to overoxidation and irreversible inactivation by ROS in vitro. In the presence of BSH, S-bacillithiolation protects the active sites against irreversible oxidation and functions in reversible inactivation. Using molecular docking it was further shown that BSH can undergo disulfide formation with the GapDH and AldA active site Cys residues without major conformational changes. In C. diphtheriae, the glycolytic GapDH was identified as main target for S-mycothiolation under HOCl stress (chapter 5). In addition, GapDH is also the most abundant protein in the Cys proteome of C. diphtheriae. Exposure of purified GapDH to H2O2 and NaOCl resulted in irreversible inactivation due to overoxidation of the active site in vitro. Treatment of GapDH with H2O2 or NaOCl in the presence of MSH resulted in S-mycothiolation and reversible GapDH inactivation in vitro, which was faster compared to the overoxidation pathway. Reactivation of S mycothiolated GapDH was catalyzed by the Trx and the Mrx1 pathways in vitro. De-mycothiolation by Mrx1 was faster compared to Trx. Thus, it is interesting to note that the glycolytic GapDH is a major target for S-thiolation by BSH and MSH across Gram-positive bacteria. To identify novel redox-sensing regulators in S. aureus USA300 that could provide protection under HOCl stress, we used an RNA- seq transcriptomic approach. We identified the novel Rrf2-family redox-sensing regulator HypR as most strongly induced under NaOCl stress in the transcriptome under NaOCl stress (chapter 6). HypR was characterized as redox- sensing repressor that negatively controls expression of the hypR-merA operon and directly senses and responds to NaOCl and diamide stress by a thiol-based redox switch. Mutational analysis identified Cys33 and the conserved Cys99 as essential for NaOCl-sensing while Cys99 is also important for repressor activity of HypR in vitro and in vivo. The redox-sensing mechanism of HypR involves Cys33-Cys99' intersubunit disulfide formation by NaOCl stress both in vitro and in vivo. Moreover, the HypR-controlled flavin disulfide reductase MerA was shown to protect S. aureus against NaOCl stress and increased survival in J774A.1 macrophage infection assays. We were further interested to investigate the changes in the BSH redox potential under NaOCl stress in S. aureus. Thus, we constructed a genetically encoded bacilliredoxin-fused Brx- roGFP2 redox biosensor for dynamic live-imaging of BSH redox potential changes in S. aureus during the growth, oxidative stress and under antibiotics treatment (chapter 7-8). The Brx-roGFP2 biosensor showed a specific and rapid response to low levels BSSB in vitro which required the active-site Cys of Brx. However, the biosensor was unresponsive to other LMW thiol disulfides in vitro. Dynamic live-imaging in two MRSA isolates USA300 and COL revealed fast and dynamic responses of the Brx-roGFP2 biosensor under NaOCl and H2O2 stress and constitutive oxidation of the probe in different BSH-deficient mutants. Using confocal laser scanning microscopy, the changes in the BSH redox potential in S. aureus were confirmed at the single cell level. In phagocytosis assays with THP-1 macrophages, the biosensor was 87 % oxidized in S. aureus COL. However, no changes in the BSH redox potential were measured after treatment with different antibiotics classes indicating that antibiotics do not cause oxidative stress in S. aureus. Our studies demonstrate that this novel Brx-roGFP2 biosensor catalyzes specific equilibration between the BSH and roGFP2 redox couples and can be used for dynamic live imaging of the BSH redox potential inside S. aureus. Future studies are directed to apply this Brx-roGFP2 biosensor for screening of the BSH redox potential across S. aureus isolates of different clonal complexes to reveal the differences in pathogen fitness and in their ROS detoxification capacities as defense mechanisms against the host immune system. In addition, this biosensor can be applied in drug research to screen for new ROS-generating antibiotics that affect the BSH redox potential in S. aureus.

Glutathion (GSH) ist die wichtigste niedermolekulare Thiolverbindung in eukaryontischen Organismen und Gram-negativen Bakterien, um die Redoxbalance aufrechtzuerhalten (Kapitel 1-2). Gram-positive Bakterien produzieren kein GSH, sondern dafür alternative Thiolverbindungen. Bacillithiol (BSH) fungiert als alternative Thiolverbindung in Firmicutes, wie z.B. in Bacillus subtilis und Staphyloccoccus aureus. Mycothiol kommt dagegen als wichtigste Thiolverbindung in allen Actinomycetes vor, wie z.B. in Mycobakterien und Corynebakterien. Niedermolekulare Thiolverbindungen spielen eine wichtige Rolle bei post-translationalen Modifikationen nach oxidativem Stress, wobei Cysteine zu S-Thiolierungen oxidiert werden können. S-Thiolierungen schützen die Thiolgruppe vor irreversibler Oxidation zur Cystein-Sulfonsäure und fungieren als Redox-Schalter. Das Hauptziel dieser Arbeit war es, neue Thiolschalter und S-Thiolierungen im Thiolredoxproteom in den pathogenen Bakterien S. aureus and Corynebacterium diphtheriae nach HOCl stress zu identifizieren. HOCl ist ein sehr reaktives Oxidant und wird von Neutrophilen während der Infektion produziert. HOCl ist deshalb für die Abwehr des angeborenen Immunsystems gegen Bakterien von großer Bedeutung. Im Thiolredoxproteom von S. aureus USA300 konnten mittels der OxICAT-Methode 58 NaOCl-sensitive Cysteine identifiziert werden, die >10% erhöhte Oxidation nach NaOCl-Stress aufwiesen (Kapitel 3 4). Dazu zählten fünf S-bacillithiolierte Proteine, wie z.B. die Aldehyd-Dehydrogenasen GapDH und AldA, die ca. 29 % stärker oxidiert waren in der OxICAT-Analyse. GapDH und AldA sind in ihrem katalytischen Zentrum S-bacillithioliert, am Cys151 von GapDH und am Cys279 von AldA. GapDH ist das am häufigsten vorkommende S-bacillithiolierte Protein, welches mit 4% zum Gesamt-Cystein-Proteom in S. aureus beiträgt. Die katalytischen aktiven Zentren von GapDH und AldA sind sehr sensitiv gegenüber Überoxidationen und irreversiblen Inaktivierungen durch ROS in vitro. In Gegenwart von BSH und ROS kommt es zur S-Bacillithiolierung der aktiven Zentren von GapDH und AldA. Die S-Bacillithiolierung dient als Schutz der Thiolgruppe vor Überoxidation und führt ebenfalls zur reversiblen Inaktivierung der Enzyme. Durch molekulares Docking konnte weiterhin gezeigt werden, dass die S-Bacillithiolierung der Cysteine in den aktiven Zentren von GapDH und AldA keine Konformationsänderungen erfordert. In C. diphtheriae wurde die glykolytische GapDH als S-mycothioliert nach HOCl-Stress identifiziert (Kapitel 5). GapDH ist ebenfalls das am häufigsten vorkommende Protein im Cystein-Proteom von C. diphtheriae. Nach Exposition von gereinigtem GapDH mit H2O2 und NaOCl kam es zur Überoxidation des aktiven Zentrums zur Sulfonsäure, was zur irreversiblen Inaktivierung führte. Die Oxidation von GapDH durch H2O2 und NaOCl in Gegenwart von MSH führte zur S-mycothiolierung und reversiblen GapDH Inaktivierung in vitro. Kinetische Messungen zeigten weiterhin, dass die S-Mycothiolierung schneller ablief als die Überoxidation zur Sulfonsäure. Die Reaktivierung von S mycothiolierten GapDH konnte sowohl durch den Trx-Pathway als auch durch Mrx1 katalysiert werden in vitro. Die Reduktion der Mycothiolierungen mittels Mrx1 verlief wesentlich schneller im Vergleich zur Reduktion durch Trx. Somit wurde hiermit die glykolytische Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase GapDH als ein wichtiges S-thioliertes metabolisches Enzym in verschiedenen Gram-positiven Bakterien identifiziert und charakterisiert. Wir waren weiterhin interessiert, neue HOCl-spezifische redox-sensitive Regulatoren zu identifizieren. Dazu wurde eine RNA-seq Transkriptomanalyse nach NaOCl-Stress durchgeführt. Wir konnten einen neuen Regulator der Rrf2-Familie identifizieren, der sehr stark durch HOCl-Stress im Transkriptom induziert wurde (Kapitel 6). HypR wurde als neuer redox- sensitiver Repressor charakterisiert, der die Expression des hypR-merA-Operons negativ reguliert. HypR wird direkt nach NaOCl und Diamid-Stress über eine reversible Thioloxidation reguliert. Durch Mutagenese wurde gezeigt, dass Cys33 und das konservierte Cys99 essential für das Redox-sensing nach NaOCl- Stress sind. Cys99 ist ebenfalls wichtig für die Repressor-Aktivität von HypR in vitro und in vivo. HypR wird nach NaOCl-Stress durch eine intermolekulare Disufidbrückenbildung zwischen Cys33 und Cys99' in vitro und in vivo reguliert. HypR reguliert die Flavin-Disulfid-Oxidoreduktase MerA. Es konnte gezeigt werden, dass MerA am Schutz von S. aureus gegenüber NaOCl-Stress beteiligt ist und zum Überleben in Infektionsassays mit Makrophagen beiträgt. Unsere weiteren Untersuchungen zielten darauf ab, die Veränderungen im BSH- Redoxpotential in S. aureus nach oxidativen Stress zu messen. Dafür wurde ein genetisch-kodierter Bacilliredoxin-fusionierter Brx-roGFP2-Biosensor konstruiert für die Analyse des BSH-Redoxpotentials in S. aureus während des Wachstums, nach oxidativem Stress und nach Antibiotika-Behandlung (Kapitel 7-8). Der Brx-roGFP2-Biosensor zeigte eine spezifische und schnelle Oxidation nach Inkubation mit geringen Mengen BSSB in vitro, welche auf das aktive Zentrum von Brx zurückzuführen war. Keine Oxidation des Biosensors wurde nach Inkubation mit anderen niedermolekularen Thiolverbindungen gemessen. Biosensor-Messungen in zwei MRSA-Isolaten USA300 und COL zeigten eine schnelle und dynamische Oxidation des Brx-roGFP2 Biosensors nach NaOCl und H2O2-Stress. Der Biosensor war konstitutiv oxidiert in verschiedenen BSH-negativen S. aureus Mutanten. Durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie konnten die Veränderungen im BSH-Redoxpotential in S. aureus auf Einzelzell-Ebene bestätigt werden. Nach Infektionsversuchen mit THP-1 Makrophagen wurde eine 87 %-ige Oxidation des Biosensors in S. aureus COL gemessen. Jedoch wurden keinen Veränderungen des BSH-Redoxpotentials nach Behandlung mit verschiedenen Antibiotika nachgewiesen. Dies weist darauf hin, dass Antibiotika in S. aureus keinen oxidativen Stress verursachen. Unsere Untersuchungen zeigten, dass der neue Brx-roGFP2 Biosensor eine spezifische Äquilibrierung zwischen den BSH und roGFP2 Redoxpaaren katalysiert. Deshalb kann der Biosensor weiterhin in S. aureus angewandt werden für dynamische Messungen des BSH-Redoxpotentials. In zukünftigen Studien soll der Brx-roGFP2 Biosensor für das Screening des BSH- Redoxpotentials in S. aureus-Isolaten verschiedender klonaler Komplexe eingesetzt werden. Somit könnten Unterschiede in der Fitness und Entgiftung von ROS zwischen verschiedenen S. aureus-Isolaten untersucht werden als Abwehrmechanismen gegen das Immunsystem des Wirts. Der Biosensor kann ebenfalls in der Antibiotika-Forschung eingesetzt werden, um nach neuen ROS- produzierenden Antibiotika zu screenen, die einen Einfluss auf das BSH- Redoxpotential von S. aureus haben.