Regulierte intramembranäre Proteolyse des Transferrinrezeptors 1

Abstract

Der Transferrinrezeptor 1 (TfR1) ist ein homodimeres Typ II Transmembranprotein und vermittelt die Eisenaufnahme über die Bindung des eisenbeladenen Transferrin in die Zelle. Die transferrinbindende extrazelluläre Domäne wird von einem als a disintegrin and metalloproteinase (ADAM) bezeichneten Enzym im juxtamembranen Teil des TfR1 C-terminal von Arginin 100 geschnitten. Der dabei entstehende lösliche Transferrinrezeptor (sTfR) dient als diagnostischer Marker für erythropoetische Aktivität, besonders um zwischen einer Eisenmangelanämie und einer inflammatorischen Anämie zu unterscheiden, wobei die biologische Funktion des sTfR1 unverstanden ist. Der Verbleib des durch die Proteolyse der Ektodomäne entstandenen membranständigen N-terminalen Fragments (NTF) des TfR1 ist unbekannt. Für Typ I Transmembranproteine wie dem Notch- oder dem ErbB4-Rezeptor konnte eine weitere intramembranäre Proteolyse zur Proteindegradierung oder für weitere Signaltransduktionen nachgewiesen werden. Dies gelang für Typ II Transmembranproteine erst im Jahr 2002 nach der Entdeckung der Signalpeptidpeptidase ähnlichen-Proteasen (SPPL) für die Substrate Tumornekrosefaktoralpha (TNFα), FasLigand und british dementia Protein (Bri2). Im Laufe dieser Arbeit konnte mit Hilfe eines N-terminal Flag-getaggten und C-terminal V5-getaggten TfR1-NTF zum ersten Mal gezeigt werden, dass das TfR1-NTF intramembranär gespalten wird. Das dabei extrazellulär entstehende C-Peptid des TfR1 (TfR1-Cp) wurde im Medium als oxidiertes Monomer, d. h. mit einer intramolekularen Disulfidbrücke zwischen dem Cystein 89 und 98 nachgewiesen. Zudem konnte die Sequenz des TfR1-Cp mit Hilfe der MALDI-TOF- TOF-MS-Analyse bestimmt werden. Die intramembranäre Proteolyse erfolgte demnach zwischen dem Glycin 84 und dem Tyrosin 85. Weiterhin wurden polyklonale Antikörper gegen TfR1-Cp in Kaninchen generiert und aus dem Kaninchenserum aufgereinigt. Diese Antikörper wurden für die Etablierung eines Sandwich-ELISA zum Nachweis des TfR1-Cp im Serum verwendet. Es konnte eine hohe Spezifität des Sandwich-ELISA mit Hilfe eines kompetitiven ELISA, bei dem biotinyliertes TfR1-Cp mit verschiedenen Mengen ungelabeltem TfR1 versetzt wurde, gezeigt werden. Weiterhin wurde mit Hilfe des ELISA humanes Albumin als Interaktionspartner des TfR1-Cp identifiziert. In dieser Arbeit konnte zudem gezeigt werden, dass die endogene Protease für die intramembranäre Proteolyse des TfR1-NTF ein Mitglied der GxGD-Aspartylproteasen, speziell der SPP/SPPL- Familie ist. Weitere Experimente mit überexprimierten SPPLs oder ihren katalytisch inaktiven Mutanten zeigten bei SPPL2a und SPPL2b eine erhöhte Freisetzung des TfR1-Cp. Während bei der katalytisch inaktiven SPPL2b D/A überhaupt kein TfR1-Cp detektiert werden konnte, zeigte die Überexpression der katalytisch inaktiven SPPL2a D/A eine verringerte jedoch nicht vollständig unterdrückte Freisetzung des TfR1-Cp gegenüber Kontrollzellen. Zudem konnte eine Kolokalisierung der SPPL2b mit dem TfR1-NTF nachgewiesen werden, dies gelang nicht für die SPPL2a. Dies weist auf die SPPL2b als Hauptprotease des TfR1-NTF hin, während die SPPL2a die am Prozess unwesentlichere Protease zu sein scheint. Ferner gelang es in einer Kooperation mit Frau Fluhrer (DZNE, LMU, München) die intrazelluläre Domäne des TfR1 (TfR1-ICD) in Membranlysaten von mit SPPL2b überexprimierten Zellen nachzuweisen. Die physiologische Bedeutung der intramembranären Proteolyse des TfR1-NTF und der entstehenden Fragmente TfR1-Cp und TfR1-ICD ist ungeklärt. Die intramembranäre Proteolyse könnte dem Abbau des TfR1 oder weiteren Regulationsmechanismen der Zelle und des Körpers dienen. Während die TfR1-ICD in der Zelle als zellulärer Regulator für einen Eisenmangel fungieren könnte, könnte das TfR1-Cp als systemischer Regulator für eine Freisetzung von Eisen aus retikuloendothelialen Makrophagen oder den Enterozyten des Darms durch eine mögliche Stabilisierung des Eisenexportproteins Ferroportin wirken. Dies ist rein spekulativ und müsste noch bewiesen werden.

The transferrin receptor-1 (TfR1) is a homodimeric type II transmembrane protein and mediates the cellular iron uptake via binding of ferri- transferrin. The extracellular transferrin binding domain is cleaved by a disintegrin and metallo- (ADAM) protease C-terminal of arginin-100 within the juxtamembrane region of the ectodomain. The thereby generated soluble TfR1 (sTfR1) is used as a diagnostic marker for erythropoietic activity, in particular to discriminate between iron deficiency anemia and anemia of inflammation, however, the physiological function of sTfR1 is unclear. The fate of the remaining N-terminal fragment of the TfR1 (TfR1-NTF) is unknown so far. For type I transmembrane proteins such as Notch or ErbB4 receptor, an intramembrane proteolysis for further protein degradation or for subsequent signaling is known. For type II transmembrane proteins, this was the case after the discovery of new proteins in 2002 referred as signalpeptide peptidase-like proteases (SPPL) that cleave substrates such as tumornecrosis factor-α (TNF-α), Fas ligand and the british dementia protein (Bri2). In this work the intramembrane proteolysis of TfR1-NTF was detected for the first time by using an N-terminal Flag tag and a C-terminal V5 tag fused to the TfR1-NTF. The generated extracellular C-terminal peptide of TfR1 (TfR1-Cp) was detected as an oxidized monomer, with an intramolecular disulfide bridge between cystein-89 and cystein-98. Furthermore, the sequence of the peptide was determined by a fragmentation analysis via MALDI-TOF-TOF-MS, which revealed that intramembrane proteolysis occurs between glycin-84 and tyrosin-85. Furthermore, polyclonal antibodies against the TfR1-Cp were generated in rabbit and purified to be used for a sandwich-ELISA that was established to determine the TfR1-Cp amount in human serum. There was a high specificity detected by using a competitive assay with biotinylated TfR1-Cp and different amounts of unlabelled TfR1-Cp. In addition, human serum albumin was identified as an interaction partner of TfR1-Cp by using the sandwich-ELISA. Moreover, the endogenous protease for the intramembrane proteolysis of the TfR1-NTF was identified in this work. It belongs to the GxGD-aspartyl proteases, especially to the SPP/SPPL-family. Further experiments with overexpressed SPPLs and their catalytically inactive mutants showed an increased release of TfR1-Cp from cells overexpressing SPPL2a and SPPL2b. By using the catalytically inactive mutant SPPL2b D/A, absolutely no TfR1-Cp was detectable, whereas with the catalytically inactive SPPL2a D/A a reduced but not completely abolished TfR1-Cp signal was observed in contrast to the control cells. Furthermore, a colocalisation of TfR1-NTF with SPPL2b but not with SPPL2a was detected in the plasma membrane using confocal fluorescence microscopy. This indicates that the SPPL2b is the major protease responsible for TfR1-NTF cleavage and the SPPL2a only the minor one. In a cooperation with Regina Fluhrer (DZNE, LMU, Munich) it was possible to detect the intracellular domain of the TfR1 (TfR1-ICD) in membrane lysates obtained from cells with co-expression of SPPL2b. The physiologic relevance of the intramembrane proteolysis of the TfR1-NTF and of the released fragments TfR1-ICD and TfR1-Cp is unknown. The intramembrane proteolysis could be useful for the denaturation of the TfR1 or for further regulation within the cell or in body. The TfR1-ICD might be valuable as a cellular regulator for iron deficiency whereas the TfR1-Cp could act as a systemic iron regulator for the iron release from reticuloendothelial macrophages or from the enterocytes in the intestine by stabilizing the iron exporter Ferroportin, but this is speculative and has to be proven.