Die Spinozerebelläre Ataxie Typ 2 ist eine neurodegenerative Erkrankung, welche autosomal dominant vererbt und durch eine expandierte CAG-Wiederholung im SCA2-Gen ausgelöst wird. Die genaue Funktion des SCA2-Genprodukts Ataxin-2 (ATXN2) ist noch nicht ganz verstanden. Aufgrund struktureller Eigenschaften sowie experimentellen Beobachtungen wird ATXN2 eine Rolle im RNA-Metabolismus, bei der Endozytose und bei der Organisation des Aktin-Zytoskeletts zugeschrieben. Erste Yeast-two-Hybrid-(Y2H)-Analysen mit ATXN2 resultierten in der Identifizierung des transkriptionellen Regulators ZBRK1 (BRCA1-interacting protein with a KRAB domain 1) als potentiellen Interaktionspartner von ATXN2, welcher an der Reprimierung von Genen beteiligt ist. Weitergehende Analysen konnten die Assozierung beider Proteine mittels Y2H- und Ko- Immunopräzipitations-Experimenten bestätigen. Mikroskopische Analysen zeigten eine Ko-Lokalisierung beider Proteine im Zellkern. Interessanterweise konnte eine Korrelation zwischen erhöhter sowie reduzierter ZBRK1- und ATXN2-Expression beobachtet werden, was die Bildung eines regulatorischen Komplex‘ bestehend aus ZBRK1 und ATXN2 vermuten ließ. Bioinformatische Analysen mit dem bekannten ZBRK1-Bindemotiv führten zur Identifizierung potentieller ZBRK1-Bindemotive im SCA2-Promotor, welche durch Chromatin- Immunopräzipitation(ChIP)-, Promotoranalysen sowie durch Generierung eines spezifischen Intrabodys mit ZBRK1/ATXN2-interferierenden Eigenschaften charakterisiert wurden. Bemerkenswerterweise konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass ATXN2 als Ko-Regulator von ZBRK1 an der Aktivierung der eigenen SCA2-Transkription beteiligt ist, und somit den ersten Ko-Aktivator von ZBRK1 darstellt. Durch kombinierte bioinformatische Analysen und ATXN2-Defizienz- Experimente, konnte ein neues Zielgen des Komplexes, die Serine/Threonine- Kinase ATM (Ataxia telangiectasia mutated), identifiziert- sowie eine Aktivierung der ATM-Transkription durch den ZBRK1/ATXN2-Komplex mittels ChIP- bzw. Promotoranalysen bestätigt werden. Erste Hinweise aus Y2H-Analysen ließen eine Abnahme der ZBRK1/ATXN2-Interaktion mit zunehmender Polyglutaminlänge im ATXN2-Protein (ATXN2Q79) vermuten, welche wiederum anhand einer geringeren SCA2- bzw. ATM-Promotoraktivität durch die Expression von ATXN2Q79 bestätigt werden konnte. Abschließend konnte in Zellen, welche ATXN2Q79 exprimierten und mit oxidativem Stress behandelt wurden, eine veränderte Phoshorylierung der ATM-Substrate beobachtet werden, welche eine mögliche Konsequenz der beeinträchtigten ZBRK1/ATXN2Q79-Aktivierung von ATM sein könnte. Zusammenfassend konnte zum ersten Mal eine Beteiligung von ATXN2 in der transkriptionellen Aktivierung von Genen gezeigt werden. Interessanterweise beeinträchtigt die pathogene Polyglutaminexpansion diese Aktivierung des ATM- Promotors Demzufolge könnte eine Kombination aus transkriptioneller Dysregulation und einer veränderten Phosphorylierung der ATM- Substrate einen potentiellen Mechanismus in der Pathogenese von SCA2 darstellen.
Spinocerebellar ataxia type 2 is an autosomal dominant inherited neurodegenerative disease, which is caused by an expanded CAG-repeat in the SCA2 gene. The cellular function of the SCA2 gene product Ataxin-2 (ATXN2) is not yet entirely understood. Protein function prediction and experimental studies have involved ATXN2 in RNA metabolism, endocytosis and in the organisation of the actin-cytoskeleton. Yeast-to-hybrid (Y2H) and co- immunoprecipitation assays have shown that ATXN2 interacts with ZBRK1 (BRCA1-interacting protein with a KRAB domain 1) and, microscopic analyses have shown co-localisation of both proteins in the nucleus. Over-expression and Knock-down experiments exhibited a correlation between ZBRK1 and ATXN2 transcripts levels, suggesting that a complex comprising ZBRK1 and ataxin-2 might regulate SCA2 gene transcription. Furthermore, bioinformatic analysis using the known ZBRK1 consensus DNA-binding motif revealed ZBRK1 binding sites in the SCA2 promoter. These predicted sites were experimentally validated by chromatin-immunoprecipitation, promoter-reporter assays and, disruption of ZBRK1/ATXN2 interaction by intrabody over-expression. Our results confirm that ataxin-2 acts as a co-regulator of ZBRK1 activating its own transcription. This work shows evidence for the first ZBRK1 co-activator described in the literature. Thereafter a combination of bioinformatic analysis and perturbation experiments resulted in the identification of a new target: the serin/threonin kinase ATM (Ataxia telangiectasia mutated). Predicted ZBRK1-binding sites in the ATM promoter were confirmed by chromatin- immunoprecipitation experiments. Promoter-reporter analyses showed an elevated ATM-promoter-activity when ZBRK1 and ATXN2 were over-expressed, illustrating a transcriptional activation of ATM through the ZBRK1/ATXN2 complex. Interestingly, ATXN2Q79 over-expression reduced the levels of both SCA2 and ATM promoter activity and caused a modified phosphorylation pattern on ATM substrates under oxidative stress conditions. Consequently, transcriptional deregulation and impaired phosphorylation of ATM substrates might constitute a potential mechanism in the pathogenesis of SCA2.
