DNAzyme sind synthetische katalytisch aktive Desoxyribonukleinsäuren, mit der Fähigkeit RNA sequenzspezifisch zu hydrolysieren und so die Translation zu inhibieren. DNAzyme (10-23er DNAzym) leiten sich prinzipiell von den Ribozymen ab, deren Wirkmechanismus ein ähnlicher ist. Sie können als Konstrukte, sowohl zur Untersuchung von Genfunktionen als auch zur Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze eingesetzt werden. Da DNAzyme aus einzelsträngiger DNA bestehen, ist es notwendig, diese vor einer Degradation durch DNAasen zu schützen. Der bisher am häufigsten verwendete Ansatz zur Stabilisierung von DNAzymen ist der Einbau von Phosphothioaten. Dass diese jedoch einige nachteilige Eigenschaften und Nebenwirkungen aufweisen, ist aus der Forschung mit Antisense- Oligodesoxyribonukleotiden bekannt. Es treten in vivo sowohl spezifische als auch unspezifische Nebenwirkungen auf, die die therapeutische Dosis limitieren. In dieser Arbeit wird die Entwicklung eines neuen zirkulären, kovalent geschlossenen DNAzyms, dem Circozym dargestellt. Das Circozym besitzt eine etwa 70bp lange Loop-Stem-Loop Struktur und enthält die katalytisch aktive Sequenz eines konventionellen 10-23 DNAzyms. Das Circozym wurde am Beispiel von TEL/AML1 (ETV6/RUNX1) mRNA entwickelt. TEL-AML1 ist eine der häufigsten genetischen Rearrangements bei akuter lymphoblastischer Leukämie im Kindesalter. Es konnte gezeigt werden, dass erstaunlicherweise die katalytische Aktivität des Circozyms durch die strukturelle Veränderung zu einer Hantelform nicht verloren geht. Da das Circozym verglichen mit Phosphothioat-stabilisierten DNAzymen vergleichbare Stabilität besitzt, scheint die phosphothioatfreie Form der Stabilisierung von DNAzymen gerade in Hinsicht auf eine in vivo-Nutzbarkeit interessant.
DNAzymes represent a new generation of catalytic nucleic acids for specific RNA targeting in order to inhibit protein translation from the specifically cleaved mRNA. The 10-23 DNAzyme was found to hydrolyze RNA in a sequence- specific manner both in vitro and in vivo. Although single-stranded DNAzymes may represent the most effective nucleic acid drug to date, they are nevertheless sensitive to nuclease degradation and require modifications for in vivo application. However, previously used stabilization of DNAzymes by site-specific phosphorothioate (PT) modifications reduces the catalytic activity, and the PT displays toxic side effects when applied in vivo. Thus, improving the stability of DNAzymes without reducing their catalytic activity is essential if the potential of these compounds should be realized in vivo. The Circozyme was tested targeting the mRNA of the most common genetic rearrangement in pediatric acute lymphoblastic leukemia TEL/AML1 (ETV6/RUNX1). The Circozyme exhibits a stability comparable to PT-modified DNAzymes without reduction of catalytic activity and specificity and may represent a promising tool for DNAzyme in vivo applications. The inclusion of the catalytic site and the specific mRNA binding sequence of the DNAzyme into a circular loop-stem- loop structure (Circozyme) of approximately 70 bases presented here is a new effective possibility of DNAzyme stabilization.
