Origins of DNA replication are the cis elements, which are specifically recognized by trans factors called initiators. The Origin Recognition Complex (ORC), a six-subunit protein complex selects the sites of DNA replication in eukaryotes. A uniformly distributed origin sequences is a basic necessity for the precise duplication of eukaryotic genome. However in humans, no uniform pattern of origin selection is reported to date. This is mainly attributed to the unspecific DNA binding by human ORC. The work presented in this thesis focused on the unspecific DNA binding activity of human ORC. We reconstituted a recombinant HsORC where sequence specific DNA binding is artificially imposed through a heterologous DNA binding domain. In vitro DNA binding analysis with purified recombinant protein showed the high degree of specificity for the target DNA sequences. The affinity of artificial protein for target DNA sequence was several folds more as compared to the affinity of the wild type protein for the AT rich sequences. In a parallel approach using these engineered initiator genes, we tried to establish in vivo replication of the plasmid with specific sequences in mammalian cells. Recognition of initiator proteins to DNA sequences lead to the assembly of protein factors, which initiate DNA replication, preferentially at these sites. Plasmids without specific sequences failed to replicate in mammalian cells. This system provides an effective way to analyze the function of mammalian initiator proteins. Our study has practical implications for the development of episomal vectors in gene delivery.
Zusammenfassung Origins für die DNA-Replikation sind cis-Elemente, die spezifisch durch trans-Faktoren, die man Initiatoren nennt, erkannt werden. Der Origin Recognition Complex (ORC) besteht aus sechs Untereinheiten und bindet die Origins bei der Initiation der DNA-Replikation von Eukaryoten. Die gleichmäßig auf der DNA verteilter Origin-Sequenzen sind Grundvoraussetzung für genaue Verdopplung des Genoms. Jedoch ist beim Menschen bisher keine einheitliche Origin-Sequenz bekannt. Der Grund dafür liegt in der unspezifischen DNA-Bindung der humanen ORC-Proteine. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der unspezifischen DNA-Bindung der humanen ORC-Proteine. Dafür wurden rekombinante ORC-Proteine hergestellt, die sich durch eine künstlich eingeführte DNA-Bindedomäne spezifisch an bestimmte DNA-Sequenzen binden können. Durch in-vitro-DNA-Bindungsanalysen konnte die Bindung dieser rekombinanten Proteine an spezifische DNA-Zielsequenzen gezeigt werden. Des Weiteren konnte eine deutlich höhere Affinität dieser Proteine zur Zielsequenz nachgewiesen werden, als das Wildtyp-Protein zu einer AT-reichen DNA-Sequenz. In weiteren Versuchen wurden die rekombinanten Initiatorgene in vivo getestet, wobei die Replikation von Plasmiden mit den spezifischen Zielsequenzen in Säugetierzellen untersucht wurde. Aufgrund der Erkennung der Zielsequenzen durch die Initiatorproteine erfolgte die Rekrutierung von anderen Replikationsfaktoren, die daraufhin die Replikation der Plasmide verursachten. Dagegen zeigten Plasmide ohne diese Zielsequenzen keine Replikation in den Zellen. Diese Methode erlaubt eine effektive Analyse der Funktion der Replikationsinitiationsproteine von Säugetieren. Des Weiteren könnte dieses System Anwendungen bei der Entwicklung von episomalen Vektoren für die Gentherapie finden.