In dieser Doktorarbeit wurde der Einfluss des TJ-Proteins Cld-6, das bei Überexpression in Mäusen zu einem starken transepidermalen Wasserverlust und dadurch zum Tod kurz nach der Geburt führte, auf den transepithelialen Wassertransport an MDCK-C7-Zellen untersucht. Dabei handelt es sich um eine Nierenzelllinie, die einschichtig und konfluent wächst, TJ ausbildet und ein Modell für ein dichtes Epithel darstellt. Die MDCK-C7-Zellen wurden mit Cld-6-cDNA stabil transfiziert (C7-Cld-6). Als Kontrolle benutzte man die mit identischem, aber leerem CMV4-Vektor transfizierte gleiche Zelllinie (C7-CMV4). Zusätzlich wurden die Untersuchungen an den untransfizierten MDCK-C7-Wildtypzellen (C7-WT) durchgeführt. Der Vergleich der C7-WT- mit den C7-CMV4-Zellen zeigt, dass allein die Transfektion mit dem leeren Vektor die Eigenschaften und endogene Proteinexpression der Zellen verändern kann. Daher sollte in allen Studien mit transfizierten Zellen als Kontrolle stets die aus der gleichen Ursprungskultur hergestellten Vektorkontrollen herangezogen werden. Die erfolgreiche Transfektion mit Cld-6 wurde mit der Western-Blot- Technik nachgewiesen. Die korrekte Lokalisation von Cld-6 in den TJ wurde mit Hilfe der Immunfluoreszenzfärbung in Kombination mit der konfokalen Mikroskopie bestätigt. Es zeigte sich eine Kolokalisation von Cld-6 und Occludin, das nur in den TJ vorkommt. Die Expression von Cld-6 verändert die elektrophysiologischen Eigenschaften nicht, der transepitheliale Widerstand, die Permeabilitäten für Natrium und Chlorid und auch das Verhältnis Kationen- zu Anionenpermeabilität war in den Cld-6-transfizierten Zellen nicht verändert gegenüber den Leervektor-transfizierten Zellen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Cld-6 keine porenbildenden Eigenschaften besitzt. Im Gegensatz dazu ist der hier gemessene transepitheliale Wassertransport in den C7-Cld-6-Zellen höher als in den C7-CMV4-Zellen und zwar unabhängig davon, ob er durch einen osmotischen Gradienten, einen ionalen Gradienten oder der Kombination von beiden induziert wurde. Da Cld-6 die Expression anderer TJ-Proteine und auch die des AQP-1 beeinflusst, kann dieser Effekt nicht eindeutig Cld-6 als wasserleitender Komponente zugeordnet werden. Möglicherweise ist die erhöhte Expression von AQP-1 für einen erhöhten transzellulären Wasserflux und/oder die veränderte Claudinzusammensetzung der TJ für einen erhöhten parazellulären Wasserflux verantwortlich. Die Tatsache, dass Cld-6, das hauptsächlich embryonal exprimiert wird, die Expression endogener Proteine beeinflusst, untermauert die These, dass Cld-6 eine bedeutende Stellung in regulatorischen Zellprozessen einnimmt.
In this thesis the influence of the TJ protein claudin-2 (Cld-6) on the transepithelial water transport in MDCK-C7 cells was investigated. It has been shown that Cld-6 overexpression in mouse causes a strong trans-epidermal water loss and thereby leads to death shortly after birth. The kidney cell line MDCK-C7 grows confluent and single-layered, forms TJ and serves as a model for a tight epithelium. The MDCK-C7 cells were stably transfected with Cld-6 cDNA (C7-Cld-6), the same cells transfected with the empty-vector (C7 CMV4) serves as control. In addition, studies on non-transfected MDCK-C7 wild-type cells (WT-C7) were performed. The comparison of C7-WT with C7 CMV4 cells indicates that the transfection with the empty vector can change properties and endogenous protein expression of the cells. Therefore, the vector controls from the same original cell culture should be used as controls in all studies with transfected cells. The successful transfection with Cld-6 was detected by the Western blot. The correct localization of Cld-6 within the TJ was confirmed by immunofluorescence staining and confocal microscopy. There, a colocalization of Cld-6 and the TJ marker occluding was found. The expression of Cld-6 did not alter transepithelial resistance, the permeabilities for sodium and chloride and the ratio of cation to anion permeability. These results suggest that Cld-6 has no pore-forming properties. In contrast, the transepithelial water transport in C7-Cld-6 cells was higher than in C7-CMV4 cells. This effect cannot be unambiguously attributed to Cld-6 as water conducting TJ protein, since the expression of other TJ proteins and of the water channel AQP-1 was altered in C7-Cld-6 cells. Possibly, the increased expression of AQP-1 was responsible for an increased transcellular water flow and / or the altered composition of the TJ proteins caused an elevated paracellular water flow. The fact that Cld-6, which is mainly expressed in embryonic development, influences the expression of endogenous proteins supports the thesis of an involvement in regulatory processes of the cell.
