Phytochrome sind Photorezeptoren mit einem Bilin-Chromophor, bei denen rotes Licht eine Konversion zwischen einer Rotlicht-absorbierenden Pr-Form und einer Dunkelrotlicht-absorbierenden Pfr-Form auslöst. In dem Bodenbakterium Agrobacterium tumefaciens kommen zwei Phytochrome, Agp1 und Agp2, vor. Diese besitzen antagonistische Eigenschaften. Agp1 konvertiert im Dunkeln allmählich von Pfr zu Pr, während bei Agp2 die Pr-Form allmählich in eine Pfr-Form umgewandelt wird. Die Photokonversion wird durch eine stereochemische Änderung am Chromophor eingeleitet, die in mehreren Schritten zu einer Strukturveränderung des Proteins führt. Um die Stereochemie des Chromophors Biliverdin in der Pr- und Pfr-Form von Agp1 und Agp2 zu untersuchen, wurden 6 verschiedene arretierte Chromophore verwendet. In diesen wurden ausgewählte Doppel- und Einzelbindungen in einer bestimmten Konfiguration und Konformation fixiert. Diese Derivate bildeten mit beiden Phytochromen kovalente Addukte mit charakteristischen spektralen Eigenschaften. Mit Hilfe Protein-analytischer Methoden wurde gezeigt, dass der Agp1- und Agp2-Chromophor in der Pr-Form die Stereochemie 5Zs/10Zs/15Za und in der Pfr-Form die Stereochemie 5Ea/10Zs/15Ea oder 5Za/10Zs/15Ea besitzt. Durch die strukturellen lichtinduzierten Veränderungen am Chromophor werden Konformations-Änderungen am Protein eingeleitet. Diese wurden im zweiten Teil der Arbeit am vollständigen Agp1 Protein und verschiedenen Fragmenten von Agp1 untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Histidin-Kinase von Agp1 eine stabile Dimerisierung des Moleküls vermittelt. Das M15-Fragment, das nur aus dem Chromophor-Modul besteht und keine Histidin-Kinase besitzt, kann ebenfalls Dimere bilden, die nach Verdünnung aber dissoziieren. Es zeigte sich, dass die Interaktion der Dimeruntereinheiten von M15 in der Pfr-Form stärker war als in der Pr-Form. Die Konstrukte M20 und M15Δ18N entstanden aus M15 durch die Entfernung der PHY-Domäne bzw. der ersten 18 N-terminalen Aminosäuren. Beide Fragmente assemblierten mit Biliverdin und bildeten photoaktive Produkte. Der im Vergleich zu Agp1 und M15 geringe Extinktionskoeffizient dieser Photoprodukte ist für eine unvollständige Photokonversion charakteristisch. Mit Limitierter Proteolyse wurde gezeigt, dass die hinge Region zwischen dem Chromophormodul und der Histidin-Kinase sowie ein Teil der PHY-Domäne in der Pfr-Form von Agp1 exponiert sind. Die Daten dieser Arbeit resultieren in dem folgenden Modell für die Photokonversion von Agp1: Die lichtinduzierte Veränderung der Stereochemie des Chromophors bewirkt eine stärkere Assoziation der N-terminalen Dimeruntereinheiten und eine Exposition der hinge Region, womit eine größere Entfernung der Histidin-Kinase-Untereinheiten voneinander und eine geringere Phosphorylierungsaktivität von Agp1 nach Bestrahlung einhergehen.
Phytochromes are photoreceptors with a bilin chromophore in which light triggers the conversion between the red-absorbing form Pr and the far-red- absorbing form Pfr. The soil bacterium Agrobacterium tumefaciens has two phytochromes, Agp1 and Agp2, with antagonistic properties. In darkness, Agp1 converts slowly from Pfr to Pr, whereas Agp2 converts slowly from Pr to Pfr. Photoconversion is initiated by a change of the stereochemistry of the chromophore which induces structural changes of the protein. To understand the chromophore stereochemistry in the Pr- and Pfr-form of Agp1 and Agp2 six different synthetic chromophores were used. Selected single and double bounds of these chromophores were locked in a special conformation or rather configuration. All locked BV-derivatives formed covalent adducts with Agp1 and Agp2. These adducts had characteristic spectral properties. As shown by protein analytical methods the Agp1 and Agp2 chromophore has a 5Zs/10Zs/15Zs stereochemistry in the Pr-form and a 5Ea/10Zs/15Ea or 5Za/10Zs/15Ea stereochemistry in the Pfr-form. Stereochemical changes of the chromophore induce conformational changes of the protein. In the second part of this work the conformational changes of the protein during chromophore assembly and photoconversion were analyzed with full-length Agp1 and several truncation fragments thereof. I found that the C-terminal histidine kinase module of Agp1 mediates stable dimerisation. The fragment Agp1-M15, which comprises the chromophore module but lacks the histidine kinase module, can also form dimers, but these dimers may dissociate during dilution. Subunit interaction was stronger for the far-red absorbing form Pfr than for the red absorbing form Pr. The fragments Agp1-M20 and Agp1-M15Δ18N are derived from Agp1-M15 by truncation of the PHY-domain or 18 amino acids from the N-terminus of the protein, respectively. Both fragments incorporate the chromophore and the adducts are photoactive. In comparison to Agp1 and M15 these photoproducts have a rather low extinction coefficient. This is characteristic for incomplete photoconversion. An intramolecular crosslink which is apparently formed between the region 9-19 and the PHY-domain shows that both parts of the protein interact with each other. With limited proteolysis it was found that the hinge region between the chromophore module and the histidine kinase and a part of the PHY-domain are exposed in the Pfr-form. The data of this work result in the following model for photoconversion of Agp1: Light induces stereochemical changes of the chromophore, which lead to a stronger association of the N-terminal subunits of the dimer and the exposition of the hinge region. This results in an increased distance of the histidin kinase subunits and a lower phosphorylation activity of Agp1 after irradiation.
