PCs sind für die endoproteolytische Spaltung von zahlreichen Proproteinen, zu denen auch Integrine, EZM-Bestandteile und Peptidhormone gehören, während ihres Reifungsprozesses verantwortlich. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Regulation und Funktion der Proprotein Convertase PC5 in der primären Zellkultur von glatten Gefäßmuskelzellen der Ratte. Zunächst konnten mittels RT-PCR mRNA-Transkripte von Furin, PC7 und beiden Isoformen PC5A und PC5B in den kultivierten VSMCs nachgewiesen werden. Fluoreszenzmikroskopische Kolokalisationsstudien zeigten, dass das PC5 und Furin im TGN lokalisiert sind. Das TGN ist der Ort an dem die Proproteine im konstitutiven Proteinsekretionsweg durch die PCs endoproteolytisch gespalten und aktiviert werden. Die phänotypisch veränderten glatten Gefäßmuskelzellen sind die Hauptlieferanten der Bestandteile der EZM in atherosklerotisch veränderten Gefäßen. Steigerung der Proteinbiosynthese, die mit gestiegener Aktivität der prozessierenden Enzyme verbunden sein muss, erfolgt unter Einwirkung von Hypertrophen- und Wachstumsfaktoren. In dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass die Proprotein Convertase PC5 in VSMCs selektiv durch dass PDGF- BB und nicht durch Ang II hochreguliert wird. Furin und PC7 blieben von der Stimulation beider Zytokine unbeeinflusst. Untersuchungen der Zeitkinetik der PC5-Stimulation durch PDGF erbrachten einen signifikanten Anstieg des PC5 bereits nach 30 Min. Der PDGF-BB induzierte PC5-Anstieg konnte durch den PI3-Kinase Inhibitor Wortmannin und noch stärker durch den mTOR/p70S6-Kinase Inhibitor Rapamycin reduziert werden. Der MAP-Kinase Inhibitor PD98059 konnte den PDGF bedingten PC5-Anstieg nicht vermindern. Proliferation und Migration der glatten Gefäßmuskelzellen tragen zu der Entwicklung und Progression der Atherosklerose und Restenose nach therapeutischen Eingriffen bei. Die selektive Hemmung der Proprotein Convertase PC5 durch Antisense- Oligonukleotide verminderte die Adhäsion und Migration der VSMCs auf Vitronektin. Die FKS-induzierte Proliferation der VSMCs wurde durch die Anwendung der PC5-Antisense nicht beeinträchtigt. Bei der Adhäsion und Migration der Zellen spielen Integrine eine entscheidende Rolle. PC5 -Antisense-Oligonukleotide verminderten die Prozessierung der alpha-v-Integrinuntereinheit, die als Bestandteil der dimeren Integrinrezeptoren alpha-v/beta-3 und alpha-v/beta-5 als Hauptbindungspartner des Vitronektins in den VSMCs fungiert. Ausgehend von den dargestellten in vitro Ergebnissen in der primären Zellkultur der VSMCs, kann eine herausragende Rolle von PC5 bei der Aktivierung der alpha-v-Integrinuntereinheit in vivo postuliert werden.
PC5 is a member of the subtilisin/kexin-like mammalian proprotein convertasas (PCs) which activate several proproteins like growth factors, adhesion molecules by endoproteolytic cleavage. This type of cleavage takes place at the carboxyl side of basic residues with the general motif (Lys/Arg)-(Xn)-(Lys/Arg). Using RT-PCR we found in the culture of rat aortic vascular smooth muscle cells (VSMCs) PC5, furin and PC7. Similar to the rodent aorta organ culture the other known PCs: PC1, PC2 and PACE4 were not detectable. Immunofluorescence double-labeling showed the presence of PC5 in the trans-Golgi network which is the place of the proprotein-activation. Stimulation of VSMCs with platelet-derived growth factor PDGF-BB led to strong upregulation of PC5, whereas angiotensin II had no effect on PC5 protein levels. Time course analysis revealed a rapid increase in PC5 levels after 30 minutes of PDGF-stimulation of VSMCs. PDGF stimulated PC5 induction was inhibited by PI3-kinase inhibitor wortmanin and by rapamycin, an inhibitor of p70S6-kinase. In contrast, the mitogen-activated protein kinase (MAPK)–pathway inhibitor PD98059 did not inhibit PDGF-stimulated induction. Integrins play an important role for VSMCs migration during development of atherosclerosis and restenosis. Western blot experiments demonstrated that the downregulation of PC5-protein with specific PC5-antinsense oligonucleotides inhibits the activation of alpha-v-integrin subunit. Folowing to this the adhesion an migration of VSMCs on alpha-v/beta-3 and beta-5 ligand vitronectin was reduced after the VSMCs-treatment with PC5-antisense oligonucleotides.
