Identification and functional characterization of a genetic defect in the kinetochore protein BOD1 associated with autosomal recessive mental retardation and oligomenorrhea

Abstract

In the course of systematic clinical and molecular studies to identify intellectual disability (ID) causing defects that follow an autosomal recessive mode of inheritance (ARID), we found a single 4.3 Mbp interval on chromosome 5q with a LOD score of 4.41 by autozygosity mapping in a family with four females affected by mild to moderate ID and oligomenorrhea. By sequencing the coding regions of all 28 genes within this region we discovered a nonsense mutation in exon 2 of the BOD1 gene. This defect co-segregated with the disease and was not found in 720 Iranian and German control chromosomes. All other genes within the interval were not affected by nucleotide changes. BOD1 is expressed in a wide range of tissues, including brain and ovary. By RT-PCR, we identified two previously unknown isoforms of BOD1 in control lymphoblast and fibroblast cells and showed expression of all four transcripts in a variety of brain tissues. qRT-PCR revealed loss of all BOD1 isoforms in patient fibroblasts, including splice variants that did not contain exon 2. For all transcripts except one, this seems to be due to nonsense mediated decay, as defect of this mRNA could be abrogated by cycloheximide treatment of the cells. Absence of BOD1 protein in cells of the patients was confirmed by Western blotting experiments. BOD1 is required for proper chromosome segregation and correction of synthelic chromosomes during mitosis (Porter et al. 2007). Fibroblasts from two different patients showed several abnormalities in cell division (chromosomal bi-orientation, mitotic index, mitotic timings, increased levels of Plk1 activity, etc.) which are all in line with the findings in the BOD1 depleted HeLa cells (Porter et al. 2007; Porter et al. unpublished) and may also provide an explanation for the oligomenorrhea observed in this family. In patient fibroblasts, confocal indirect immunoflorescence imaging revealed nuclear structural defects. Subsequent overexpression experiments using BOD1 cDNA in HaCat cells were performed to further investigate the cell biology of this protein in non- dividing cells and provided preliminary evidence for an involvement of BOD1 in nuclear and chromatin organization. This indicated a putative role in the regulation of gene expression and whole genome expression profiling in patient lymphoblast cells showed deregulation of target genes that are critical for human cognition. Moreover, in patient cells the formation of primary cilia was found to be defective. Cilia defects have been observed previously in several other disorders involving ID. Finally, overexpression experiments in murine primary neuronal cells showed co-localization of GFP-tagged BOD1 with presynaptic proteins, suggesting a putative function of BOD1 in neuronal synapses, which could be an explanation for the ID observed in our patients. In summary, our results provide evidence indicating that BOD1 plays critical roles in cell cycle progression, the formation of primary cilia, chromatin organization and the regulation of transcription. Furthermore our observations suggest that in humans, this protein is required for normal brain function, which may be related to the role of BOD1 in the regulation of PLK1 during brain development. However, further in depth functional investigations are needed to shed more light on the precise role of this protein during brain development and in fully differentiated neuronal tissues.

Im Zuge unserer klinischen und molekularen Studien zur Identifizierung der genetischen Ursachen autosomal-rezessiver geistiger Behinderung, untersuchten wir eine iranische Familie mit vier Patientinnen, welche einen milden bis mittelschweren Grad geistiger Behinderung sowie Oligomenorrhoe aufweisen. Mittels Autozygosity Mapping wurde ein 4,3 Mbp Intervall auf Chromosom 5 identifiziert, welches 28 Gene beinhaltet. Die kodierenden Bereiche dieser Gene wurden sequenziert und als einzige Nukleotidänderung wurde eine Nonsense Mutation in Exon 2 des BOD1 Gens nachgewiesen. Diese Mutation co-seggregiert mit der Krankheit und wurde nicht in 720 iranischen und deutschen Kontroll- Chromosomen gefunden. BOD1 wird in einer Vielzahl von Geweben exprimiert, einschließlich des Gehirns sowie der Eierstöcke. Durch RT-PCR wurden zwei bislang unbekannte Isoformen BOD1s entdeckt, die ebenfalls im Gehirn exprimiert werden. qRT-PCR zeigte den Verlust aller Isoformen in Fibroblasten der Patientinnen. Für alle Isoformen bis auf eine ist hierfür vermutlich nonsense mediated decay verantwortlich, da in dieser mRNA der Defekt durch die Behandlung mit Cycloheximid aufgehoben wurde. Die Abwesenheit von BOD1 in den Zellen der Patientinnen wurde auch mittels Western Blot nachgewiesen. BOD1 wird für die korrekte Chromosomentrennung und die Korrektur der synthelischen Chromosomen während der Meiose benötigt (Porter et al. 2007). In Übereinstimmung mit bereits beschriebenen Anomalien, welche in HeLa Zellen ohne BOD1 auftreten (Porter et al. 2007; Porter et al. unveröffentlicht), wiesen Fibroblasten der Patientinnen mehrere Abnormitäten während der Zellteilung auf (chromosomale Biorientierung, mitotischer Index, zeitliche Koordinierung der Mitose, erhöhte Plk1 Aktivität, etc.), welche eine Erklärung für die Oligomenorrhoe der Patientinnen bieten. Die Untersuchung von Interphase Fibroblasten der Patientinnen mittels konfokaler indirekter Immunfloureszenz ergab, dass strukturelle Defekte des Zellkerns vorliegen. Überexpression von BOD1 in sich nicht teilenden HaCat Zellen zeigte eine Beteiligung von BOD1 an der Zellkern- und Chromatinorganisation, was eine putative Rolle BOD1s bei der Regulierung der Genexpression nahe legt. Whole Genome Expression Profiling in Lymphoblasten der Patientinnen zeigte eine Deregulation von Zielgenen, die entscheidend für die humane Kognition sind. Darüber hinaus ist die Formation der primären Zilien in den Zellen der Patientinnen fehlerhaft. Schäden an Zilien wurden in einer Vielzahl von Krankheiten die mit geistiger Behinderung einhergehen beobachtet. Letztendlich zeigten Überexpressionsstudien in murinen primären neuronalen Zellen Co- Lokalisation von GFP getaggten BOD1 mit Page: 168 präsynaptischen Proteinen, was auf eine putative Funktion von BOD1 in neuronalen Synapsen hinweist, deren Beeinträchtigung zu der in den Patientinnen beobachteten geistigen Behinderung führen könnten. Unsere Ergebnisse zeigen die kritische Beteiligung BOD1s am Zellzyklus, an der Formation primärer Zilien, der Chromatinorganisation sowie der Regulierung der Transkription. Des Weiteren weisen unsere Beobachtungen darauf hin, dass BOD1 für die normale Gehirnfunktion des Menschen notwendig ist, was im Zusammenhang mit der Rolle BOD1 als Regulator von PLK1 während der Gehirnentwicklung im Zusammenhang stehen kann. Weiterführende funktionelle Studien sind nötig um die genaue Funktion BOD1s während der Gehirnentwicklung und besonders im differenzierten neuronalen Gewebe aufzuklären.