GABA (gamma-aminobutyric acid) is the major inhibitory neurotransmitter in the central nervous system (CNS). GABA re-uptake by GABA transporters from the synaptic cleft is one important mechanism in the regulation of GABA concentration in the synaptic cleft. GABAergic dysfunction is involved in a lot of diseases such as Parkinson’s disease, epilepsy, chorea Huntingtone and schizophrenia. The GABA transporter 1 (GAT1) belongs to the family of Na+ and Cl--coupled transport proteins and possesses 12 putative transmembrane domains and three N-glycosylation sites in the extracellular loop between the transmembrane domain 3 and 4. Previous work showed that N-glycosylation, but not terminal trimming of the N-glycan is involved in the attainment of a correctly folded and stable conformation of GAT1, which influences on the protein stability and trafficking to the plasma membrane. It also demonstrated that N-linked oligosaccharides side chains of GAT1, in particular their terminal structures, are involved in the GABA transport process of GAT1. Sialic acids are negatively charged terminal sugar residues on the oligosaccharide chains of cell surface or serum glycoconjugates, which are involved in a broad range of biological and pathological processes. In this work, we examined the effect of deficiency, removal or oxidation of surface sialic acid residues on GABA uptake activity to investigate their role in the GABA uptake of GAT1. We found that the reduced concentration of terminal sialic acid on N-glycans was paralleled by a decreased GABA uptake activity of GAT1 in CHO Lec3 cells (mutant defective in sialic acid biosynthesis) in comparison to CHO cells. Likewise, either enzymatic removal or chemical oxidation of terminal sialic acids using sialidase or sodium periodate (NaIO4), respectively, resulted in a strong reduction of GAT1 activity. Kinetic analysis revealed that deficiency, removal or oxidation of terminal sialic acids did not affect the KmGABA values. However, deficiency and removal of terminal sialic acids of GAT1 reduced the VmaxGABA values with a reduced apparent affinity for extracellular Na+, suggesting a reduced affinity of GAT1 for Na+ and slowed kinetics of the transport cycle. Oxidation of cell surface sialic acids also strongly reduced VmaxGABA without affecting both affinities of GAT1 to GABA and Na+, respectively, indicating further that not only is the negative charge involved, but also the unique structure of sialic acid itself is crucial for the GABA uptake process. These results demonstrated for the first time that the terminal sialic acid of N-linked oligosaccharides of GAT1 is directly involved in regulation of GABA uptake process of GAT1. Based on the correlation between the reduction of the GABA uptake activity and the reduction of the terminal sialic acid concentration of GAT1/GFP, a primary screening model using GAT1 transfected cell culture was established for the selection of potent inhibitors of GAT1 activity by regulating N-glycan trimming or sialic acid biosynthesis. The influence of the candidate compounds on GAT1 activity can quickly determined by performing GABA uptake assay in GAT1/GFP stable trasfected Hek293 cells. Thus the compounds which have inhibitory effect on GAT1 activity could be selected. In this work, several synthetic N-acyl hexosamines, such as GlcNProp, GlcNCyclo, GlcNHex, GlcNAc- Acetamido and 3-O-Met-GlcNAc was found to have inhibitory effect on GABA uptake activity of GAT1 as inhibitors of N-glycan trimming or sialic acid biosynthesis. Besides, several naturally occurring compounds were used for selection of potent inhibitors on GABA uptake activity of GAT1. Resveratrol was found to exhibit a typical non-competitive inhibition on GABA uptake of GAT1. In order to perform structural analysis of GAT1 protein, GAT1/GFP fusion protein was functionally expressed in mammalian (Hek293) cells, as well as in insect Sf9 cells by BAC-TO-BACTM-Baculovirus expression system. Different chromatography methods including affinity chromatography, ion-exchange chromatography and size exclusion chromatography were tested for the purification of this protein. A two-step purification procedure for GAT1/GFP fusion protein from insect Sf9 cells was established containing immuno- affinity chromatography using self-prepared anti-GFP and size exclusion-FPLC. Certain amount (200-300 g per 400-600 mL culture) GAT1/GFP protein can be purified, which was analysed by transmission electron microscopy (TEM) analysis. Different buffer conditions were tested to obtain homogenous GAT1/GFP fusion protein. TEM results showed different formations of purified GAT1/GFP fusion protein with different detergents and certain amount of the monomers of GAT1/GFP fusion protein has been isolated.
GABA (gamma-Aminobuttersäure) ist der wichtigste inhibitorische Neurotransmitter des Zentralnervensystems (ZNS). Die Wiederaufnahme von GABA durch GABA-Transporter ist ein bedeutender Mechanismus zur Regulation der Konzentration dieser Substanz im synaptischen Spalt. Störungen in der GABA- Regulation werden mit vielen Krankheiten wie beispielsweise Parkinson, Epilepsie, Chorea Huntington oder Schizophrenie in Zusammenhang gebracht. Der GABA-Transporter 1 (GAT1) gehört zu der Familie der Na+/Cl- gekoppelten Transporter. Es besitzt 12 vermeintliche Transmembrandomänen (TMD) und drei N-Glykosylierungstellen in der extrazellulären Schleife zwischen der dritten und vierten TMD. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass N-Glykosylierungen und nicht das terminale Trimmen von N-Glykanen für die korrekte Faltung und stabile Konformation von GAT1 eine Rolle spielen; was wiederum die Proteinstabilität und den Transport an die Plasmamembran beeinflussen. Es wurde zudem gezeigt, dass N-Glykan Seitenketten von GAT1, insbesondere die terminalen Oligosaccharide, am GABA-Transportprozess von GAT1 beteiligt sind. Sialinsäuren sind terminale negativ geladene Zuckerstrukturen an Oligosaccharideketten auf Zelloberflächen oder Serumglykokonjugate, die an vielfältigen biologischen und pathologischen Prozessen beteiligt sind. In der vorliegenden Arbeit untersuchten wir die Rolle von Sialinsäuren auf die GABA- Wiederaufnahmeaktivität von GAT1. Wir stellten fest, dass die Erniedrigung der Sialinsäurekonzentration auf Zelloberflächen mit der Abnahme der GABA- Wiederaufnahmeaktivität korreliert: In CHO Lec3-Zellen mit defekter Sialinsäurebiosynthese war diese Aktivität im Vergleich zu normalen CHO Zellen erniedrigt. Auch den enzymatischen Verdau durch Sialidase sowie chemische Oxidation von terminalen Sialinsäuren durch Natriumperiodat (NaIO4) führte zur Reduktion der GAT1-Aktivität. Kinetische Analysen ergaben, dass das Fehlen von terminalen Sialinsäuren - sei es durch Verdau oder Oxidation - keinen Einfluss auf den Km-Wert für GABA hat. Vielmehr wurde dadurch der Vmax für GABA reduziert; einhergehend mit einer offensichtlichen Reduktion der Affinität für extrazelluläres Natrium. Das Fehlen von terminalen Sialinsäuren führt demnach zu einer reduzierten Affinität von GAT1 zu Na+ und einer verlangsamten Kinetik des Transportzyklus. Die Oxidation von Oberflächensialinsäuren reduzierte den Vmax von GAT1 stark, ohne dabei die Affinität für GABA und Na+ zu beeinflussen. Diese Tatsache weist darauf hin, dass nicht nur die negative Ladung von Sialinsäuren, sondern auch ihre Struktur eine bedeutende Rolle beim GABA-Wiederaufnahmeprozess spielt. Mit dieser Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass terminale Sialinsäuren auf N-Glykanen am GABA- Wiederaufnahmeprozeß von GAT1 direkt beteiligt sind. Aufgrund der Korrelation zwischen der Reduktion der terminalen Sialinsäuren auf GAT1 und dessen GABA- Wiederaufnahmeaktivität wurden erste Screenings hinsichtlich der Wirkung von mutmaßlichen Sialinsäurenbiosyntheseinhibitoren auf die GAT1-Aktivität in GAT1- transfizierten HEK293-Zellen durchgeführt. In dieser Arbeit wurden einige synthetische N-Acylhexoamine auf ihre inhibitorische Wirkung hinsichtlich der GABA-Wiederaufnahme hin überprüft. Verbindungen wie GlcNProp, GlcNCyclo, GlcHex, GlcNAc-Acetamido und 3-O-Met-GlcNAc wurden als Inhibitor der Sialinsäurebiosynthese und GABA-Aktivität von GAT1 identifiziert. Neben vielen natürlichen Substanzen, die hier ebenfalls untersucht wurden, zeigte Resveratrol eine typische nicht-kompetitive Inhibition der GAT1-Aktivität. Um strukturelle Analysen des GAT1-Proteins durchzuführen, wurde GAT1/GFP als funktionelles Fusionsprotein sowohl in die Säugerzelllinie HEK293 als auch die Insektenzelllinie Sf9 über das BAC-TO-BAC™-Baculovirus-System exprimiert. Unterschiedliche Chromatographiemethoden einschließlich Affinitätschromatographie, Ionaustauschchromatographie und Gelfitration wurden für die Reinigung dieses Proteins getestet. Eine zweistufige Reinigungsprozedur mit GFP-Immunoaffinitätschromatographie und Gelfiltration konnte für das GAT1/GFP Fusionsprotein von Sf9 Zellen erfolgreich etabliert, und das so aufgereinigte GAT1/GFP unter dem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) analysiert werden. Unterschiedliche Pufferbedingungen wurden getestet, um homogenes GAT1-GFP Fusionsprotein zu erhalten. TEM Ergebnisse zeigten unterschiedliche Formationen von gereinigtem GAT1-GFP in unterschiedlichen Detergenzien und eine bestimmte Menge von monomerem GAT1-GFP Fusionsprotein konnten isoliert werden.
