Glycosylation is an important co- and posttranslational modification that frequently occurs in proteins. Glycans are of biological relevance as they affect many fundamental functions and properties of proteins including the structural, intracellular and immunological aspects. Malignant transformations are associated with qualitative and quantitative changes of glycan structures of all cellular glycoproteins and glycolipids. These changes could be confirmed on cells and in tissues of all experimentally-induced or naturally occurring malignancies that were analysed so far regardless of type, stage and cause of tumors. As glycans can reflect the normal or abnormal status of an individual, glycan-based biomarkers are of great interest for the diagnosis of multiple diseases including cancer and inflammation. Serum is the liquid fraction that is obtained after whole blood has been allowed to clot. It is considered to be a biological fluid suitable for biomarker discovery as it is relatively stable under various conditions as well as it is rich in glycoproteins. In the present work, whole serum from patients suffering from epithelial ovarian cancer (EOC) in all disease stages was analyzed and compared with age-matched healthy subjects and women suffering from benign ovarian masses. Further, the diagnostic performance of the proposed biomarker candidate was compared with CA125, the routine diagnostic marker, to assess whether total serum glycome can be used as a biomarker for early-stage diagnosis. For this purpose, N-glycans were digested from total serum glycoproteins, previously denatured, using the PNGase F enzyme. Samples were subsequently purified and permethylated. The characterization of total N-glycan profile was performed using MALDI-TOF mass spectrometry and glycan structural isomericity was confirmed using MALDI-TOF/-TOF-MS. The statistical evaluation of potential biomarker candidates was done using the SPSS software. Quantitative and qualitative changes in the serum N-glycome from EOC patients were expressed for the first time as a ratio that can be used as a tumor marker, which is independent from CA125 as serum glycoproteins stem from the liver whereas CA125 is expressed by the tumor itself. The proposed biomarker candidate, termed as GLYCOV, has proved its worth at any disease stage and allows discrimination between ovarian cancer and the control group consisting of patients with benign ovarian masses. More than one third of ovarian cancer patients develop ascites in the course of the disease, and almost all of them in case of cancer recurrence. The presence of ascites is usually correlated with a bad diagnosis. As this event occurs at late stages of EOC, ascites cannot be used for early-stage biomarker discovery. The exploration of ascites glycome is rather thought to complete integrated bioinformatics data and to identify usable putative biomarkers that assess treatment response of ovarian cancer. In this thesis are reported for the first time the N-glycome profiles of ascitic fluid from primary serous EOC patients that are compared with the serum N-glycome of the same patients to overcome individual-specific glycosylation pattern. For the first time, it could be demonstrated that the glycome modulations previously reported in ovarian cancer serum were also present in ascites. In addition, statistical differences between ascites and serum samples were observed for glycan antennarity, sialylation and fucosylation.
Glykosylierung ist eine wichtige und häufig vorkommende co- und posttranslationale Modifikation der Glykoproteine. Glykane sind von wichtiger biologischer Relevanz und beeinflussen die strukturellen Eigenschaften sowie die intrazellulären Funktionen von Proteinen. Maligne Transformationen gehen mit quantitativen und qualitativen Strukturveränderungen der Glykane von zellulären Glykoproteinen und Glykolipiden einher. Diese Veränderungen konnten in Zellen und Gewebe aller bislang untersuchten experimentell induzierten oder natürlich vorkommenden Tumore ohne Rücksicht auf den Typ, das Stadium oder die Ursache der Entstehung nachgewiesen werden. Da die Glykane den physiologischen und pathologischen Status eines Individuums reflektieren können, bieten glykanbasierte Serumtumormarker neue Ansätze zur Diagnostik bösartiger Tumore und Entzündungskrankheiten. Serum ist eine biologische Flüssigkeit, welche man nach Zentrifugation einer geronnenen Blutprobe erhält. Im Labor hat sich das Serum vor allem wegen dessen Stabilität unter diversen Bedingungen und der hohen Proteinkonzentration als eine geeignete Quelle für die Erforschung neuartiger Biomarker bewährt. Das Ziel dieser Arbeit war es, das Serum eines Patientinnenkollektivs mit epithelialen Ovarialkarzinomen zu untersuchen, wobei die Proben alle Stadien der Krankheit umfasst. Anschließend erfolgte ein Vergleich mit alterskorrelierten Kontrollseren von gesunden Probandinnen und Patientinnen mit gutartigen Ovarialtumoren. Im Folgenden, sollte die diagnostische Leistung des vorgeschlagenen, potentiellen Biomarkers mit der von CA125 verglichen werden. CA125 ist aktuell der einzige, klinisch erprobte und routinemäßig eingesetzte Tumormarker für die Diagnose von Ovarialkarzinomen. Für diesen Zweck wurden die N-Glykane von zuvor denaturierten Serum- Glykoproteinen unter Verwendung von PNGase F enzymatisch abgespaltet, aufgereinigt und permethyliert. Das N-Glykanprofil wurde mittels MALDI-TOFMassenspektroskopie charakterisiert und die Strukturisomere mit MALDI-TOF/-TOFMS bestätigt. Die statistische Evaluierung des potentiellen Biomarkers wurde mit Hilfe von SPSS-Software durchgeführt. Die beobachteten quantitativen und qualitativen Veränderungen des Serum-N-Glykoms von Patientinnen mit epithelialen Ovarialkarzinom wurden gegenüber gesunden Kontrollen in Form eines Quotienten ausgedrückt. Trotz der Tatsache, dass die Serum-Glykoproteine überwiegend in der Leber synthetisiert werden während CA125 vom Tumor exprimiert wird, konnte der CA125 unabhängige Quotient als potentieller Tumormarker für die Diagnose von epithelialen Ovarialkarzinomen eingesetzt werden. Der als GLYCOV bezeichnete Biomarker konnte für jedes Stadium der Krankheit und für die Diskriminierung zwischen Ovarialkarzinomen und gutartigen Ovarialtumoren validiert werden. Mehr als ein Drittel der Frauen mit Ovarialmalignomen entwickeln im Verlauf der Krankheit und bei fast jedem Rückfall Aszites. Die Gegenwart von Aszites korreliert mit einer schlechten Prognose. Aufgrund der Tatsache, dass Aszites überwiegend in Spätstadien auftritt, ist es als biologische Flüssigkeit nicht für die Erforschung neuer Biomarker geeignet. Die Erforschung des Aszites-N-Glykoms könnte aber dennoch existierende Daten aus der Bioinformatik erweitern und dazu beitragen einen geeigneten Biomarker für das Ansprechen auf die Behandlung des Ovarialkarzinoms zu identifizieren. In dieser Arbeit konnte erstmalig das Aszites-N-Glykom-Profil, welches Patientinnen mit primären, serösen, epithelialen Ovarialkarzinomen entnommen wurde, dem Serum-N-Glykom- Profil gegenübergestellt werden. Die Vergleichsseren stammten von denselben Probandinnen, um die individuumspezifischen Unterschiede beim Vergleich beider N-Glykan-Profile auszuschließen. Den Beobachtungen zufolge konnten im Aszites dieselben N-Glykan-Modulationen nachgewiesen werden, welche zuvor in Serum von Ovarialkarzinompatientinnen beobachtet wurden. Zusätzlich konnten statistisch relevante Unterschiede hinsichtlich der Antennarität, Fukosylierung und Sialylierung herausgestellt werden.
