Der induzierbare Kostimulator ICOS spielt eine wichtige Rolle in T-Zell- abhängigen Immunantworten. ICOS knock-out Mäuse weisen nach Immunisierung nur sehr kleine Keimzentren und reduzierte Immunglobulin-Spiegel auf. ICOS wird von aktivierten T-Zellen exprimiert, während sein einziger Ligand – ICOS- Ligand (ICOS-L) – hauptsächlich von Dendritischen Zellen und B-Zellen exprimiert wird. Follikuläre T-Helferzellen (TFH-Zellen) sind für die Keimzentrums-Reaktion unentbehrlich, da sie den Antigen-spezifischen B-Zellen Hilfe leisten. Eine hohe Expression des Chemokinrezeptors CXCR5 bei gleichzeitig niedriger Expression des Chemokinrezeptors CCR7 ist für die Lokalisation der TFH-Zellen in den B-Zellfollikeln entscheidend. Die Differenzierung der TFH-Zellen ist vom Mastertranskriptionsfaktor BCL-6 abhängig. Der genaue Mechanismus ist jedoch noch nicht komplett aufgeklärt. ICOS hat offensichtlich eine große Bedeutung für TFH-Zellen, da sich nur wenige TFH-Zellen bei fehlender ICOS-Kostimulation ausbilden und ICOS in hohem Maße von TFH-Zellen exprimiert wird. In der vorliegenden Arbeit wurde die Relevanz von ICOS für die Differenzierung bzw. Aufrechterhaltung von TFH- Zellen in vivo untersucht. Um Antigen-spezifische T- und B-Zellen auf Einzelzellebene zu analysieren, wurde ein murines adoptives T-/B-Kooperationssystem verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass ICOS für die initiale TFH-Zelldifferenzierung nicht erforderlich ist. Zu frühen Zeitpunkten (Tag 1 bis 4) konnten Antigen-spezifische T-Zellen bei fehlender ICOS- Kostimulation sowohl die Expression des Master¬transkriptionsfaktors BCL-6 induzieren als auch in die B-Zellfollikel einwandern. Zu späteren Zeitpunkten (Tag 7 bis 10) hingegen war die TFH-Zellzahl drastisch reduziert, was auf einen T-Zell-intrinsischen Effekt zurückgeführt werden konnte. Die Relevanz von ICOS für bereits differenzierte TFH-Zellen zu späten Zeitpunkten (Tag 6) wurde untersucht, indem die ICOS-Kostimulation durch Applikation eines blockierenden anti-ICOS-L-Antikörpers unterbrochen wurde. Ohne kontinuierliche Signale über ICOS konnten die TFH-Zellen ihren Phänotyp nicht aufrechterhalten, wobei das Überleben nicht beeinträchtigt wurde. Eine verminderte BCL-6-, CXCR5-, PD-1- und IL-21-Expression sowie eine erhöhte CCR7-Expression führten zur Konvertierung der TFH-Zellen in nicht-TFH-Zellen. Durch den Verlust des TFH-Zellphänotyps reduzierte sich zugleich die Anzahl der Antigen-spezifischen Keimzentrums-B-Zellen. Um den molekularen Mechanismus aufzuklären, der für die ICOS-vermittelte Aufrechterhaltung des TFH- Zellphänotyps verantwortlich ist, wurden umfassende Transkriptom-Analysen mittels Microarray und realtime-RT-PCR durchgeführt. Eine Vielzahl von Genen mit unterschiedlichen Funktionen wurde 6 h nach später ICOS-L Blockade in den TFH-Zellen differentiell reguliert. Zu den am stärksten regulierten Genen gehörten die Transkriptionsfaktoren BACH2 und KLF2, die in TFH-Zellen schwächer als in nicht-TFH-Zellen exprimiert wurden und nach Blockade der ICOS-Kostimulation hochreguliert wurden. Demnach ist die Kostimulation über ICOS offenbar eher für die Aufrechterhaltung als für die Differenzierung der TFH-Zellen notwendig.
The inducible costimulator ICOS plays an important role for T cell-dependent immune responses. ICOS knock-out mice develop only very small germinal centers and exhibit reduced levels of immunoglobulin upon immunization. ICOS is expressed by activated T cells whereas its only ligand – ICOS-ligand (ICOS-L) – is mainly expressed by dendritic cells and B cells. T follicular helper cells (TFH cells) are essential for the germinal center reaction as they provide help to antigen-specific B cells. High expression of the chemokine receptor CXCR5 and at the same time low expression of the chemokine receptor CCR7 are important for the localization of TFH cells in the B cell follicles. The differentiation of TFH cells depends on the master transcription factor BCL-6. However, the exact mechanisms are not fully understood yet. ICOS seems to be important for TFH cells since only low numbers of TFH cells are generated in the absence of ICOS costimulation and ICOS is expressed at high levels by TFH cells. In the present work the relevance of ICOS in vivo for the differentiation or maintenance of TFH cells respectively was analyzed. In order to analyze antigen-specific T and B cells on a single cell level a murine adoptive T/B cooperation system was used. It was shown that ICOS was not required for initial TFH cell differentiation. In particular, at early time points (day 1 to 4) antigen-specific T cells were able to induce expression of the master transcription factor BCL-6 as well as to migrate into B cell follicles in the absence of ICOS costimulation. In contrast, at late time points (day 7 to 10) TFH cell numbers were severely reduced, which was revealed to be a T cell-intrinsic effect. The relevance of ICOS for already differentiated TFH cells at late time points was analyzed by applying a blocking anti-ICOS-L antibody and thereby interrupting ICOS costimulation. Without continuous ICOS signals TFH cells were not able to maintain their phenotype, whereas the survival of the TFH cells was not affected. The reduced expression of BCL-6, CXCR5, PD-1 and IL-21 as well as the increased expression of CCR7 induced the conversion of TFH cells into non-TFH cells. The loss of the TFH cell phenotype also resulted in reduced numbers of antigen-specific germinal center B cells. To delineate the molecular mechanisms crucial for the ICOS-mediated maintenance of the TFH cell phenotype, extensive transcriptome analyses using microarrays and realtime-RT-PCR were performed. Numerous genes with various functions were differentially regulated in TFH cells 6 h after late ICOS-L blockade. The most strongly regulated genes included the transcription factors BACH2 and KLF2 which showed lower expression in TFH cells than non-TFH cells and were upregulated after blocking ICOS costimulation. In conclusion, ICOS is essential for the maintenance of the TFH cell phenotype rather than for the differentiation of TFH cells.
