Toll-like receptors (TLRs) play a pivotal role in the onset of innate immunity against invading microbial. Recently, they have been identified as potential drug-targets due to their role in the advent of various severe clinical conditions such as cancer, rheumatoid arthritis and pathogen sepsis. The main goal of this work was to discover small molecule TLR2 antagonists by virtual screening and molecular modeling. For this purpose, we developed and performed a combined structure- and ligand-based virtual screening workflow. In the structure-based part of the study, we first identified a putative small molecule binding site of which we then calculated molecular interaction fields (MIFs). These were used to identify key interactions necessary for ligand binding that were later transferred into 3D pharmacophores. Subsequently, the generated models were employed to perform virtual screening of a commercial library comprising about 3 million compounds. Through consecutive docking and visual inspection the generated virtual hits were prioritized and compounds selected for biological validation. This led to one out of ten biologically active TLR2 antagonists. In the ligand-based part of the study, a two-stepped shape- and feature-based search was performed. The first screening was performed using two known TLR2 agonists and one TLR2 signaling inhibitor with unknown target protein as query structures to search the compound collection provided by the NCI. In the second search, the two TLR2 agonists were employed as query structures. Furthermore, one TLR2 signaling inhibitor and the two most promising hits from the first virtual screening were included as query structures. Virtual screening steps were followed by experimental validation of the selected compounds. In total, nine TLR2 antagonists were identified by ligand-based virtual screening. Overall, 75 compounds were selected through virtual screening and biologically tested in an NF-κB reporter assay. In total, ten compounds showed antagonistic activity in this assay and were further characterized with regard to their effect on cytokine production in human monocytes. All compounds showed IC50 values in the micromolar range, three of them in the low micromolar range (<5 µM). In addition, four TLR2 agonists could be identified. In a next step, the binding modes of the discovered TLR2 modulators were elucidated by docking studies. Furthermore, we analyzed a series of TLR2 antagonists that were published during the course of this study. The binding mode of a series of benzotropolone derivatives could consistently be determined by docking. In the last part of our study, we integrated these compounds and the antagonists discovered in our study into a 3D pharmacophore model collection including all currently available information on TLR2 antagonism. The models were optimized and validated and can now be used to discover further TLR2 antagonists through virtual screening.
Toll-like Rezeptoren (TLRs) spielen eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung der angeborenen Immunantwort gegenüber mikrobiellen Krankheitserregern. Aufgrund ihrer Rolle bei der Enstehung verschiedener Krankheiten wie Krebs, rheumatoider Arthritis und Sepsis sind TLRs kürzlich als Target für die Arzneistoffentwicklung etabliert worden. Dementsprechend war das Hauptziel dieser Arbeit die Entdeckung von TLR2 Antagonisten durch virtuelles Screening und Molecular Modelling. Zu diesem Zweck wurde ein kombiniertes struktur- und liganden-basiertes virtuelles Screening durchgeführt. Im strukturbasierten Teil der Studie wurde als erstes eine putative Bindestelle für kleine Moleküle identifiziert, von der anschließend molecular interaction fields (MIFs) berechnet wurden. Hierdurch konnten für die Bindung von Liganden notwendige Interaktionen erkannt und mittels 3D Pharmakophoren modelliert werden. Im anschließenden Schritt wurde ein virtuelles Screening einer Datenbank mit ca. 3 Millionen kommerziell verfügbaren Verbindungen durchgeführt. Virtuelle Hits wurden durch Protein- Liganden-Docking und visuelle Inspektion priorisiert und zehn Moleküle für die biologische Testung ausgewählt. Dies führte zu einem bisher unbekannten, biologisch aktiven TLR2 Antagonisten. Im ligandenbasierten Teil der Studie wurde ein zweistufiges virtuelles Screening durch sterische Überlagerung durchgeführt. Im ersten Teil wurden zwei bekannte TLR2 Agonisten und ein Inhibitor der von TLR2 induzierten Signalkaskade als Suchstrukturen verwendet. Im zweiten Teil wurden neben den beiden bekannten TLR2 Agonisten ein weiterer Inhibitor der Signalkaskade und die zwei vielversprechendsten Hits aus dem ersten Teil benutzt. Die durch virtuelles Screening ausgewählten Strukturen wurden biologisch validiert. Insgesamt führte der ligandenbasierte Teil der Arbeit zu neun bisher unbekannten, biologisch aktiven TLR2 Antagonisten. Insgesamt wurden 75 Verbindungen durch virtuelles Screening ausgewählt und biologisch in einem NF-κB-Reporter-Assay getestet. Zehn davon zeigten antagonistische Aktivität und wurden daraufhin in Hinblick auf ihre Wirkung auf die Produktion von Zytokinen in humanen Monozyten untersucht und ihre IC50-Werte bestimmt. Alle Verbindungen zeigten Aktivität im mikromolaren Bereich, drei unter 5 µM. Darüber hinaus konnten vier TLR2 Agonisten entdeckt werden. Daraufhin wurde der Bindungsmodus der identifizierten TLR2 Modulatoren durch Dockingstudien aufgeklärt. Desweiteren analysierten wir eine Reihe von TLR2 Antagonisten, die im Verlauf dieser Arbeit anderweitig veröffentlicht wurden. Der Bindungsmodus einer Reihe von Benzotropolon-Derivanten wurde durch molekulares Docking bestimmt. Im letzten Teil unserer Studie wurde eine Sammlung von 3D Pharmakophoren generiert, die die gesamten derzeit verfügbaren Informationen über TLR2 Antagonisten integriert. Die Modelle können nun dazu verwendet werden, durch virtuelles Screening weitere TLR2 Antagonisten zu entdecken.
