The receptor tyrosine kinase EphB4 has recently become an attractive target for oncology due to its overexpression in a wide variety of human cancers and its potential involvement in tumor angiogenesis. Thus, diverse therapeutic approaches directed towards inhibition of EphB4 signaling are being developed including small molecule inhibitors of the intracellular kinase domain and biologics like immunoglobulins or peptides, which prevent extracellular ligand binding and receptor signaling. An alternative novel approach to conventional biologics is the generation of Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins). DARPins are molecules with antibody-like recognition properties characterized by binding to target molecules with high affinity and specificity. This thesis presents the in vitro selection of DARPins against EphB4 from a combinatorial library using phage display technology. Two unique DARPins were isolated, which specifically bind to the intracellular domain of EphB4. Moreover eight DARPins were selected, which specifically bind to the extracellular domain of human EphB4 with affinities in the low nanomolar range. Using surface plasmon resonance (SPR) analysis two classes of DARPins were identified. One class competes with the EphB4 ligand ephrin-B2 for binding to a common site (DARPin AB1) and the other targets different epitopes (BD2, BG9). DARPins from both classes prevent ligand induced EphB4 phosphorylation in a cell-based assay and impair tube formation by endothelial cells in vitro. Additionally AB1, which cross reacts with mouse EphB4, was shown to inhibit VEGF / FGF-2 induced angiogenesis in vivo. In summary, DARPins have been isolated which can exert antiangiogenic effects in vitro and in vivo by specifically binding to EphB4 and therefore may have the potential as therapeutics for the treatment of cancer. Finally highly selective DARPins can be used as vehicles for the delivery of toxic or diagnostic agents for therapy and also imaging. Results of this dissertation could contribute to development of an effective drug for the therapy of tumors or angiogenesis-related diseases and also to examine the underlying mechanisms.
Die Rezeptor-Tyrosinkinase EphB4 wurde aufgrund ihrer Überexpression in einer Vielzahl von humanen Tumoren und ihrer potenziellen Funktion in der Tumorangiogenese als ein attraktives Target für die Krebstherapie identifiziert. Demzufolge werden diverse therapeutische Ansätze entwickelt, bei denen die EphB4 Signaltransduktion inhibiert wird, einschließlich kleinmolekularer Wirkstoffe (small molecules) als Inhibitoren der intrazellulären Kinase-Domäne und „biologics“, wie Immunglobuline oder Peptide, die die extrazelluläre Ligandenbindung und die Signaltransduktion verhindern. Eine neuartige Alternative zu herkömmlichen Biologics stellen DARPins (Designed Ankyrin Repeat Proteins) dar. Sie gehören zu den Antikörpermimetika und sind durch eine hohe Bindungsspezifität und Bindungsaffinität gekennzeichnet. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die In vitro- Selektion von DARPins gegen EphB4 aus einer kombinatorischen Bibliothek mittels Phage Display Technologie erfolgreich durchgeführt. Dabei wurden 10 charakteristisch unterschiedliche DARPins isoliert, die hochspezifisch und mit Affinitäten im nanomolaren Bereich an die extrazelluläre Domäne und an die intrazelluläre Domäne von humanem EphB4 Rezeptor binden. Mittels Surface Plasmon Resonance (SPR)-Analyse konnte für die extracellulär bindenden DARPins gezeigt werden, dass sie sich in zwei Klassen unterteilen. Eine Klasse bindet kompetitiv mit dem EphB4-Liganden ephrin-B2 an eine gemeinsame Region des Rezeptors (DARPin AB1), während die anderen Binder unterschiedliche Epitope erkennen (BD2, BG9). Interessanterweise verhindern DARPins aus beiden Klassen die ligandinduzierte EphB4-Phosphorylierung in einem zellbasierten Assay und beeinträchtigen die Ausbildung neuer Gefäßstrukturen durch Endothelzellen in vitro. Darüber hinaus wurde in einem Maussurrogatmodell gezeigt, dass AB1, der mit Maus-EphB4 kreuzreagiert, VEGF / FGF-2 induzierte Angiogenese in vivo hemmen kann. Diese Resultate zeigen klar auf, dass die isolierten EphB4 DARPins affin und spezifisch an EphB4 binden und eine antiangiogene Wirkung in vitro und in vivo entfalten und daher das Potenzial für ein Therapeutikum zur Behandlung von Krebs besitzen. Schließlich können hochspezifische DARPins auch als Träger für therapeutisch wirksame Effektoren dienen, wie beispielsweise Toxine, Zytostatika oder Radioisotope zur Bildgebung von Tumoren. Die vorliegenden Daten könnten zu der Entwicklung eines wirksamen Medikaments für die Therapie von Tumoren und anderen angiogeneseabhängigen Erkrankungen beitragen und stellen Werkzeuge zur Verfügung, die die Untersuchung der zugrunde liegenden Mechanismen ermöglichen.
